人源性大肠癌抗原基因的SEREX 筛选

人源性大肠癌抗原基因的SEREX 筛选

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Email: wcjd@http://www.77cn.com.cn http://www.77cn.com.cnWorld Chin J Digestol 2003 September;11(9):1378-1381世界华人消化杂志　ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R

２００３　年版权归世界胃肠病学杂志社

大肠癌　COLORECTAL CANCER

人源性大肠癌抗原基因的ＳＥＲＥＸ筛选

刘宇虎，　张振书，　钟　　　东，　武金宝，　但汉雷，　赖卓胜，　王亚东，　张亚历，　肖　　　冰

刘宇虎，　张振书，　钟东，　武金宝，　但汉雷，　赖卓胜，　王亚东，　张亚历，　肖冰，中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化内科研究所广东省广州市　　５１０５１５

刘宇虎，　男，　１９６３－０６－０１生，　四川省越西县人，　博士生，　副主任医师．

国家自然科学基金项目，　　Ｎｏ．　３０１７１０５３

项目负责人：　张振书，　５１０５１５，　广东省广州市，　中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化内科研究所．　　ｚｈａｎｇｚｓ＠ｆｉｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ电话：　０２０－６１６４１５６１

收稿日期：　２００２－１２－０８　　　　接受日期：　２００２－１２－２５

Screening of human colorectal carcinomaassociated antigen genes by SEREX

Yu-Hu Liu, Zhen-Shu Zhang, Dong Zhong, Jin-Bao Wu,Han-Lei Dan, Zhuo-Sheng Lai, Ya-Dong Wang, Ya-Li Zhang,Bing Xiao

Yu-Hu Liu, Zhen-Shu Zhang, Dong Zhong, Jin-Bao Wu, Han-Lei Dan,Zhuo-Sheng Lai, Ya-Dong Wang, Ya-Li Zhang, Bing Xiao, Institute forDigestive Diseases of PLA, Nanfang Hospital, The First Military MedicalUniversity, Guangzhou 510515, Guangdong Provine, China

Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.30171053

Correspondence to: Zhen-Shu Zhang, Institute for Digestive Disease ofPLA, Nanfang Hospital, The First Military Medical University,Guangzhou 510515, Guangdong Provine, China. zhangzs@http://www.77cn.com.cnReceived: 2002-12-08 Accepted: 2002-12-25

Abstract

AIM:associated antigen genes.

To screen and identify the human colorectal carcinomaMETHODS:expression libraries were constructed. They were screened Three human colorectal carcinoma cDNA phagefrom autologous and allogeneic sera of colorectal cancerpatients by SEREX (serological identification of antigens byrecombinant expression cloning). The sera were pre-absorbedby the extractcDNA clones were isolated by immunoscreening from a E. coli XL1-blue. Four different serum-reactivecolon cancer-derived cDNA expression library. Positiveclones were amplified by plate culture, the purified lambdaphage DNA was cut by Sfi

Tripl Ex2ÊɾúÌå×÷ÔØÌåµÄ´ó³¦°©¿¹Ô-cDNA

±í´ïÎÄ¿â

ÌáÈ¡´¿»¯DNA

µÎ

¶È·Ö±ðΪ2.39×１０６　ｎｆｕ／Ｌ

插入片段长度为

０．５－４　ｋｂ

插入ｃＤＮＡ片段大小分别

为　２．４　ｋｂ

可

获得有价值的大肠癌的重组抗原基因克隆

为分离肿瘤抗原基因奠定了基础．

重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎ－ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃＤＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ＳＥＲＥＸ）可直接鉴定肿瘤抗原．　不需要特异ＣＴＬ和瘤细

胞的体外建株

解决了既往肿瘤抗原抗体反应中的关键问

题

期能发现新的

大肠癌相关基因．

１　　　材料和方法

１．１　材料　　南方医院普外科大肠癌患者手术的新鲜癌组织３例；　大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬ１－ｂｌｕｅ　和噬菌体载体

人源性大肠癌抗原基因的SEREX 筛选

购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；　Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｇｉｂｃｏ公司；　ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；　ＥｘｐａｎｄＴＭ　　ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ购自宝灵曼公司；　ＭａｘＰｌａｘＴＭ　　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｋｉｔ购自Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ公司；　硝酸纤维素膜（ＮＣ膜）购自ＰａｌｌＣｏｒｐ；　碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ抗体为ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｉｎｃ；　ＢＣＩＰ和ＮＢＴ购自ＢＢＩ公司；　ＥＸ　ＴａｇＴＭ　ｅｘｔｒｕｅ酶购自ＴａＫａＲａ；　Ｓｆｉ　

　　Ｂｉｏｍｅｔｒａ　９６０型

ＰＣＲ仪；　Ｓｉｇｍａ　３Ｋ－３０　台式冷冻高速离心机；　ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔ　凝胶图像分析仪．

１．２　方法　　用Ｔｒｉｚｏｌ　ＬＳ　ｒｅａｇｅｎｔ试剂裂解组织并提取总

ＲＮＡ用ＬＤ－ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ第２

链

消化

酶切后

与

加

入１５　ｍＬ含硫酸镁的　ＬＢ

３７　

３７　

ｈ至对

数生长期Ａ６００＝０．６－０．８．　５　０００　ｒ／ｍｉｎ弃上

清

制备

成感受态菌液冰箱存放．　按

１

沉淀细胞

重悬于１０　ｍＬ　ＰＢＳ中

于

４　

离心

１０　ｍｉｎ

同等量裂解液重复吸收３

次

冰箱存放．　取文库１　µＬ加入感受态菌液　２００　µ

Ｌ　孵育

１５　ｍｉｎ

的含硫酸镁的ＬＢ顶

层软琼脂底层硬琼脂　９０　ｍｍ

平板中

正立

３７　

用平头镊将预先高压灭菌

室温自然干燥的ＮＣ膜平铺于于平皿

上

　诱导

４　ｈ

放于湿润的纸巾

上

以固定ＮＣ膜．　平皿

４　洗涤３次

室温轻摇９０　ｍｉｎ．　１×ＴＮＴ缓冲液

洗涤３次５０或

１轻摇过夜．　１×ＴＮＴ缓冲液洗涤３

次

８００稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ抗体

中每次１０　ｍｉｎ．

凉干后

显色３０　ｍｉｎ．　阳性克隆进行第二轮和第

三轮筛选．　阳性克隆采用平板法扩增噬菌体

加入２５　µＬ氯仿

放置过夜．　取５０－１００　µＬ噬菌体悬液加入　５００　µＬ感受态菌液３７　

过夜．　平板室温

纯化

阳性克隆噬菌体

ＤＮＡ

酶切５０　

下游引物：　５

　３０　ｓ

　６０　ｓ

　　６０　Ｖ

滴度分别为２．３９×１０６

　ｎｆｕ／Ｌ

９８．６　％和９８．５　％．　插入外源ｃＤＮＡ片段大小范 …… 此处隐藏：8278字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……