食品分离技术论文

从动物细胞中提取、分离纯化蛋白质

摘要：详细介绍了动物蛋白质的常见提取、分离纯化方法，各种方法的优点，叙述了分离纯化方法的原理和主要步骤，评价分离方法的可行性，并列举了影响提取有效成分的因子。

关键词：蛋白质 提取 分离纯化 水溶液提取法 有机溶剂提取法 超滤分离技术 双水相萃取技术

蛋白质是生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的深入和对蛋白质功能、生物活性认识的提高，许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质。研究动物蛋白质的结构和功能，首先要得到高纯度的具有生物活性的目的蛋白，高效的纯化技术和手段是研究动物蛋白质的重要基础和关键之一。

1.材料的选择与预处理

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

2.动物组织的细胞破碎

主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失[1]。

一、蛋白质的提取

大部分动物组织蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂。

（一）水溶液提取法

提取动物组织蛋白质一般采用各种水溶液。稀盐和缓冲体系的水溶液对蛋白

质稳定性好、溶解度大，是最常用的溶剂。稀盐溶液（一般用NaCl 溶液）可促进动物蛋白质溶解，同时因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点[2]。

（二）有机溶剂提取法

有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或

分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。

提取的好坏受到多种因素的影响包括：

1）溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂（如尿素和盐酸胍）和粘稠度、溶液的更换；

2）材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理；

3）目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量；

4）其它因素 搅拌、提取时间的长短[2]。

二、蛋白质的分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常

数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。

根据分子大小分离纯化：

一、超滤分离技术

蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用

一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果[2]。

在离心力或较高压力下，选择适当孔径的半透膜（膜孔径1～20 nm），截留

所需的大分子蛋白质，从而实现分离。刘爱国等[8]选取硫酸铵盐析法、超滤法及盐析- 超滤结合法，从牛血清中得到免疫球蛋白粗提物。结果显示以盐析-超滤结合法分离效果最佳。

原理：超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。当液体混

合物在一定压力下流经膜表面时，小分子溶质透过膜（称为超滤液），而大分子物质则被截留，使原液中大分子浓度逐渐提高（称为浓缩液），从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。

超滤膜分离技术作为现代分离技术，因其具有设备简单、能在低温下操作、能耗小、生物活性物质不易失活、效率高等特点，近年来被广泛应用于生物活性物质的分离、浓缩和纯化[5]。

影响超滤效果的因素有料液流速，操作压力，温度，运行周期，料液的预处

理，进料浓度，膜的清洗等[2]。

二、双相水萃取技术

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取

可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产

品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中[6]。

主要步骤：

1、选择双水相系统的溶质：根据欲分离蛋白质和杂质的溶解特性，选择双

水相系统的溶质。常用水溶性高分子聚合物和各种盐类，且通常采用两种高分子化合物系统。

2、制备双水相系统：此为关键步骤。双水相系统的制备，一般是将两种分

别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。

3、萃取分离：双水相系统+欲分离蛋白质混合物→充分搅拌，混合均匀→静止→混合物中不同组分按其分配系数不同分配在两相中，并达平衡→通过离心机或其他方法将两相分开收集→达到分离目的→蛋白质 [2]。

原理：双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适

当的浓度溶解后形成 …… 此处隐藏：3017字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……