两步荧光法检测牛乳中大肠杆菌的研究

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238 2007, Vol. 28, No. 02

食品科学※分析检测

两步荧光法检测牛乳中大肠杆菌的研究

付丽娜，刘　　宁＊，霍贵成

（东北农业大学　乳品科学教育部重点实验室，黑龙江　哈尔滨　　　　　　　　１５００３０）

摘　　　要：本文主要进行了两步荧光检测牛乳中大肠杆菌的研究，确定了两步荧光法的基本条件和过程。其过程为将大肠杆菌菌悬液在ＴＢ培养基中进行１２ｈ的预培养后，取出０．１ｍｌ菌液加入到１．５ｍｌ的离心管中，再加入０．２ｍｇ／ｍｌＭＵＧ底物０．１ｍｌ和１００μｇ／ｍｌ的多粘菌素Ｂ０．０５ｍｌ培养４５ｍｉｎ，最后加入ｐＨ１０．４的０．２ｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙ－ＮａＯＨ缓冲液１．７５ｍｌ终止反应，使用荧光分光光度计测荧光密度。空白样为０．１ｍｌｍｏｌ／Ｌ　ＵＧ底物加０．０５ｍｌ　１００ｕｇ／ｍｌ的多粘菌素Ｂ，再加０．２ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ１０．４　Ｇｌｙ－ＮａＯＨ缓冲液１．７５ｍｌ。关键词：两步荧光法；检测；大肠杆菌

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｏｗｍｉｌｋ　ｂｙ　Ｔｗｏ－Ｓｔｅｐ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄ

ＦＵ　Ｌｉ－ｎａ，ＬＩＵ　Ｎｉｎｇ＊，ＨＵＯ　Ｇｕｉ－ｃｈｅｎｇ

（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈａｒｂｉｎ　　　　　　　１５００３０，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．　Ｆｉｒｓｔｌｙ，　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｗａｓ　ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　ＴＢｆｏｒ　１２　ｈｏｕｒｓ．　Ｔｈｅｎ　０．１ｍｌ　ａｌｉｑｕｏｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　０．０５ｍｌ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ（１００μｇ／ｍｌ）　ａｎｄ　　０．１ｍｌ　ＭＵＧ（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉ　ｆｅｒｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏ　ｎｉｄｅ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ　３７℃　ｆｏｒ　４５ｍｉｎ．　Ｆｉｎａｌｙ　１．７５ｍｌ　Ｇｌｙ－ＮａＯＨ　ｂｕｆｆｅｒ（０．２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ１０．４）　ｗｅｒｅ　ａｄｄｅｄ　ｔｏ　ｅｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｔｈｅ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＭＰＮ（ｍｏｓｔ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ），ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＭＰＮ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ

中图分类号：Ｏ６５７．３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００７）０２－０２３８－０３

一般情况下，食物和水中Ｅ．　ｃｏｌｉ的检测是以生长

培养基乳糖发酵、产气和形成吲哚为基础。很多年来最大近似值法　（ｍｏｓｔ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ，　ＭＰＮ）一直作为Ｅ．ｃｏｌｉ检测的典型方法，需要６～７ｄ的检测时间，时间太长，已不能适应现代化品质管理的原则，而且超过１８～２４ｈ的培养期，许多易腐败即食性产品早已上市或完成消费行为，因此Ｅ．　ｃｏｌｉ的快速检测对于生产实践具有重要意义１１．１

［１］

１．３１．３．１

方法

４－ＭＵＧ饱和底物浓度的确定

将４－ＭＵＧ溶于５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ　ｐＨ７．０缓冲液中，配

制成浓度为０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ｍｇ／ｍｌ的底物溶液，分别与浓度为１０９　ＣＦＵ／ｍｌ的Ｅ．　ｃｏｌｉ菌悬液作用，使用荧光分光光度计测量荧光密度值，每组做三个平行。１．３．２

比较ＬＳＴ培养基和ＴＢ培养基对荧光检测的影响取浓度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ的Ｅ．　ｃｏｌｉ菌悬液０．５ｍｌ，分别加到４．５ｍｌ　ＬＳＴ（月桂基硫酸盐蛋白胨，按照配方自行配制）　［２］和ＴＢ（胰蛋白胨，按照配方自行配制）　［３］培养基中，预培养５ｈ后用两步荧光法测荧光密度值，比较两种培养基对荧光检测的影响，每组做三个平行。１．３．３

多粘菌素Ｂ的作用时间的确定

取浓度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ的Ｅ．　ｃｏｌｉ菌悬液０．５ｍｌ，加入到４．５ｍｌ的ＴＢ培养基中预培养５ｈ，取出０．１ｍｌ培养液加入１．５ｍｌ离心管中，再加入多粘菌素Ｂ０．０５ｍｌ和０．２ｍｇ／ｍｌ

。

材料与方法

材料

大肠埃希氏菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ２５９２２　　　　黑龙江省应用微生物研究所；４－甲基伞形酮－β－Ｄ－葡萄糖苷酸（ＭＵＧ）　　　　Ｓｉｇｍａ公司；对－硝基苯－β－Ｄ－葡萄糖苷酸（ＰＮＰＧ）Ｓｉｇｍａ公司ｐＨ１０．４；５０ｍｍｏｌ／Ｌ苷氨酸－氢氧化钠缓冲液（Ｇｌｙ－ＮａＯＨ）　　　　ｐＨ７．０；５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）。１．２

仪器

日本日立Ｆ４５００荧光分光光度计。

收稿日期：２００５－１２－１７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊通讯作者基金项目：“十五”奶业重大专项课题（２００２ＢＡ５１８Ａ０６）

１９８－）

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※分析检测食品科学

５０４５４０３５３０２５２０１５１０５０

2007, Vol. 28, No. 02239

ＭＵＧ底物０．１ｍｌ，分别在３７℃培养０、１５、３０、４５ｍｉｎ

荧光密度

后测荧光密度值，比较不同多粘菌素Ｂ作用时间对荧光检测的影响，每组做三个平行。１．３．４

两步荧光检测法起始接菌水平与预培养时间的关系系列稀释法配制浓度为１～１０８ＣＦＵ／ｍｌ的菌悬液，每个稀释度的菌液在ＴＢ培养基中培养，每隔１ｈ采用两步荧光法检测不同浓度菌液样品的荧光密度值，记录不同浓度菌液可测得荧光的时间，每组做三个平行。２２．１

结果与分析

荧光法检测的激发波长和发射波长的确定

使用日立Ｆ４５００荧光分光光度计做４－ＭＵ和４－ＭＵＧ

０．１０．２０．３０．４０．５０．６

ＭＵＧ浓度（ｍｇ／ｍｌ）

图２　　　ＭＵＧ饱和底物浓度曲线

Fig.2 Cruve of saturating substrate concentration of MUG

和底物完全反应。２．３

ＬＳＴ培养基和ＴＢ培养基对荧光检测影响的比较

８０７０６０５０４０３０２０１００

的３Ｄ扫描，扫描图谱如图１。

３０００

６００ＥＸ（ｎｍ）

２００

２００

ＥＭ（ｎｍ）

２０００１００００

荧光密度

ＴＢ …… 此处隐藏：3068字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……