实时荧光定量PCR技术的原理及应用,注意事项,适合菜鸟入门

本文详细介绍的实时荧光定量PCR技术的原理和应用,以及在实验过程中常见的污染及其解决办法,适合菜鸟的入门学习

实时荧光定量PCR技术汇报人：朱林林 2011/03/25

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目录 实时荧光定量PCR基本原理 实时荧光定量PCR的实验设计 实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较 实时荧光定量PCR误差分析及操作规范 实验中污染的防控 荧光定量PCR报告模板

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实时荧光定量PCR基本原理

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常规vs实时 常规PCR:借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量

及定性分析。 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增 反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对 起始模板进行定量分析。

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优缺点比较

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定量PCR三个基本概念 (1)扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所 做的曲线。

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定量PCR三个基本概念 (2)阈值的概念

在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直 线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的 差值全部相同。

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定量PCR三个基本概念 (3)

CT值

PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过 的扩增循环数。

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C(t)与初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小

C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系106105 104 103

10210

荧光强度---循环数曲线

初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线

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荧光定量PCR的定量原理 浓度的对数值与循环数

呈线性关系，根据样品 扩增达到域值的循环数

(Ct值)就可分析样品中起始模板量。

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荧光定量PCR的化学原理化学方法分类 非特异性 SYBR Green I法 特异性 TaqMan探针法

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SYBR Green I法 原理：结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA,SYBR

Green结合到双螺旋小沟中，当受 到适合光源激发，发射出荧光， 反映产物浓度 优点 使用方便，无需复杂的设计 成本较低 缺点 与非特异性产物结合，无模板特 异性 试验方法较难优化 灵敏度低

AC G T GCAC T G T A G G A T G G T GT C A G CA AT CA C C A CCT

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SYBR Green I法溶解曲线分析

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荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双

链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析； (3)、SYBR GreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计 的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStar Taq酶，或者操作时 需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严 重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；

(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。 (6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。

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TaqM

an探针法 水解型

报告基团，淬灭基团 FRET(荧光谐振能量传递) 识别特异性产物 特异性高，可准确定量 灵敏度高 设计不同标记的探针，可进 行多重检测一个探针只适用于一个目标 价格较高 探针设计较繁琐

优点

缺点