质粒大量提取及纯化

扬州大学

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完成日期：本科生毕业论文 质粒大量提取及纯化 张晨 动物科学学院 动科06 宋成义 教授 2010年6月

质粒大量提取及纯化

动物科学 张晨

指导老师 宋成义

摘要：为了探讨氯霉素对重组质粒DNA提取产量的影响，本试验在含重组质粒pT2/HB-CMV-EGFP的大肠杆菌DH5α培养到对数生长期时添加氯霉素继续培养12小时，收集细菌用碱裂解法粗提质粒DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。结果表明，氯霉素可有效的促进松弛型重组质粒DNA拷贝数的增加，从而达到提高质粒DNA产量的目的。为了优化质粒DNA纯化过程中溶液A的用量，本试验将同一份粗提质粒DNA平分成三组，分别加入不同量的溶液A。纯化后测定各组DNA浓度和纯度，结果表明，溶液A用量（ml）:质粒DNA量(mg)为1:2时，纯化效果最好。

关键词：质粒提取；氯霉素；纯化

Extraction and purification of Large-scale plasmid DNA

ZHANG Chen

Abstract: To study the effect of chloramphenicol on plasmid DNA preparation, in this

experiment the chloramphenicol was added to the recombinant E. coli culture at the logarithmic growth phase，and then the plasmid DNA was extracted by using the traditional alkaline method. Concentration and purity of the plasmid DNA was detected and the results showed that

chloramphenicol could effectively increase the copy number of relaxed plasmid and increase the output of the plasmid DNA. In order to optimize the amount of solution A which was used to purify plasmid DNA, different amount of solution A was added to the coarse extraction of plasmid. Then the concentration and purity of the puritied plasmid DNA was determined.The results showed that the purification effect was the best when the proportion of solution A(ml) and coarse plasmid DNA(mg) was by 1-2.

Key Words:extract of plasmid DNA;chloramphenicol;purification;

质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子,其分子量一般在0.2～10kD范围内[1]。由于这些质粒独立于细菌染色体之外进行复制，分子量小,便于分离和提取,可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，具有稳定可靠和操作简便等优点，因此成为分子克隆的常用工具[2]。质粒DNA的提取是分子生物学实验室最常规的操作之一，其提取效率及质量对后续实验步骤(如酶切、连接、转化大肠杆菌与PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系[3]。因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义[4]。大肠杆菌因其易操作，发酵周期短，备受分子生物学工作者的青睐。因此，大肠杆菌质粒DNA的提取成为分子生物学实验中最基础和最重要的工作。

质粒DNA提取的方法有多种，归纳起来，主要有碱裂解法、煮沸法及SDS裂解法。这些方法都有三个步骤：细菌培养物的生长；细菌的收获和裂解；质粒DNA的纯化[5]。采用溶菌酶和SDS均可裂解菌体的细胞壁。经溶菌酶和SDS处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液中，用乙醇等沉淀、洗涤，即可得到质粒DNA[6]。

已报道的各种质粒提取方法各有利弊。例如，煮沸法时间短，操作简单，但是过程中反应过于剧烈,易造成质粒断裂、收率较低。而碱裂解法由于具有操作简便、纯度高、重复性好等优点,已成为目前最为广泛应用的细菌质粒DNA的常规提取方法[7]。

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性[8]。因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ，用LB液体培养基代替之也可以，只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液II中的NaOH，而不是SDS，所以叫碱裂解法，若只用SDS也能抽提得到少量质粒，这是因为SDS也是碱性的，但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外，NaOH若不是新配制的，可能会由于空气中的CO2与NaOH作用，减弱了其碱性。这一步操作要注意两点:一是，放置时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂[9]；二是，混匀动作要轻柔，既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组

DNA。加入溶液Ⅲ后，会有大量的沉淀生成，这是由于要SDS与蛋白质结合后，SDS与醋酸钾生成了PDS，PDS的溶解度要比SDS低的多，从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾，所得到的沉淀就会大大减少。

质粒DNA的纯化最主要的就是去除RNA和杂蛋白[15]。目前实验室所用的方法有溶菌酶裂解以及胰RNA酶降低宿主RNA的含量、使用有毒有机物质（苯酚和氯仿）降低细胞蛋白的浓度、实验室用诱变剂（溴化乙锭、氯化铯）离心纯化方法等。而比较常用的是苯酚—氯仿抽提法去除蛋白质。但是该方法需要多次抽提，不仅步骤繁琐，耗费时间，还会使质粒DNA受到过多的机械性剪切，使超螺旋状的DNA受到破坏，残留在质粒溶液中的酚类等有机物质对DNA聚合酶有抑制作用，特别是在PCR扩增过程中会对扩增过程产生抑制作用。此外，酚和氯仿对人体有害，且易造成环境污染。

为满足大量质粒DNA纯化的需求，近几年各种商业化纯化试剂盒应运而生，这些产品使用便捷，效果好，但是价格较高，尤其是纯化的质粒DNA需要量大时，造成研究成本较高。

本试验从两个方面提高重组质粒DNA的产量，一是探讨通过添加氯霉素至细菌培养基中，从而确定氯霉素对质粒提取量的影响。二是采用质粒大规模纯化工艺（已申请专利）对质粒进行纯化。通过添加不同量的溶液A，优化出溶液A的用量。

从而为实验室大规模提取纯化质粒DNA提供有意义的参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

含重组质粒pT2/HB-CMV-EGFP的大肠杆菌DH5α为本室保存。λDNA/Hind Ⅲ Marker购自大连宝生物工程公司。氯霉素、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、乙酸甲、冰乙酸等常规化学试剂均为上海国药集团有限公司分析纯级试剂。

1.2 宿主菌复苏

将-70℃冻存的菌种接种于琼脂平板上，于37℃生化培养箱培养16小时，待单个菌落生长状态较好时拿出置4℃保存备用。

1.3 宿主菌添加氯霉素培养

挑取上述单菌落，接种于100ml加氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养至对数期（约8小时），然后按1：25比例扩大培养。于37℃振摇培养至培养物的OD600值约为0.4（摇床转速200转/分），加入氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170ug/ml，于37℃振摇，继续培养12小时，同时设不加氯霉素的对照组。每组设3个重复。

1.4 质粒pT2/HB-CMV-EGFP大量提取

将培养好的含目的质粒的细菌培养物，用标准碱裂解法[2]提取质粒DNA。所获得的DNA溶液称为质粒粗提液。取200uL粗提液用2 …… 此处隐藏：5810字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……