高效液相色谱_荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质

高效液相色谱_荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质

学报

JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2010，41（4）：367－371

367

高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质

张璐璐，冯芳

（中国药科大学

摘

要

1

11，2*

，叶小敏，朱杰，马冯飞

111

药物分析教研室；

2

药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京210009）

建立高效液相色谱-荧光分析方法，研究小鼠脑皮层、海马、纹状体、丘脑等不同部位的单胺类神经递质及其

5μm），采用LichrospherC18柱（250mm×4.6mm，流动相为pH相关物质。脑组织样本经高氯酸沉淀蛋白后进行色谱分析，

3.06缓冲液（含1mmol/L庚烷磺酸钠；30mmol/L磷酸二氢钠-磷酸溶液）-甲醇（85∶15）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。荧光检测：激发波长为280nm，发射波长为315nm。采用建立的方法，鉴别出小鼠脑中存在去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、3，4-二羟苯乙酸和5-羟吲哚乙酸等物质；对NE、DA和5-HT进行定量研究，酪氨酸、色氨酸、确定2.6～519.5ng/mL（r=0.9994），2.4～469.3ng/mL（r=它们的线性范围分别为2.4～471.0ng/mL（r=0.9996），

0.9991），日内、日间RSD均小于9.0%，准确度达到限度要求，提取回收率大于90%。本法专属性好，准确度高，可以反映不同鼠脑区域单胺类神经递质及相关物质含量上的差异。

关键词

高效液相色谱-荧光分析；单胺类神经递质；相关物质；脑组织

R917

文献标识码

A

文章编号

1000－5048（2010）04－0367－05

中图分类号

Determinationofmonoamineneurotransmittersandrelatedsubstancesin

mousebraintissuebyHPLC-FLD

ZHANGLu-lu1，FENGFang1，2*，YEXiao-min1，ZHUJie1，MAFeng-fei1

1

DepartmentofPharmaceuticalAnalysis;2KeyLaboratoryofDrugQualityControlandPharmacovigilance(MinistryofEducation)，

ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China

AbstractToestablishanHPLC-FLDmethodfortheinvestigationofmonoamineneurotransmittersandrelatedsubstancesinmousefrontalcortex，hippocampus，striatum，andhypothalamus.Mousebrainsamplesweredepro-teinizedbyperchloricacidandanalyzed.TheseparationwascarriedoutonaLichrospherC18column(250mm×4.6mm，5μm).ThemobilephasewascomposedofpH3.06buffer(including1mmol/Lheptanesulfonicacidsodiumsalt，30mmol/LNaH2PO4-H3PO4solution)andmethanolintheratioof85∶15;theflowratewas1.0mL/minandthecolumntemperaturewas35°C.Fluorescencedetection:theexcitationandemissionwavelengthsweresetatλex=280nm，λem=315nm.Undertheoptimizedconditions，norepinephrine(NE)，dopamine(DA)，5-hydroxytryptamine(5-HT)，3，4-dihydroxy-phenylaceticacid(DOPAC)，5-hydroxyindoleaceticacid(5-HIAA)，tyrosine(Tyr)，andtryptophan(Trp)inmousebrainweredetected.NE，DA，and5-HTwerequantified.Theline-arityrangesofNE，DA，and5-HTwere2.4-471.0ng/mL(r=0.9996)，2.6-519.5ng/mL(r=0.9994)，and

2.4-469.3ng/mL(r=0.9991)，respectively.Theintra-andinter-dayprecisionwasalwayslowerthan9.0%．Theaccuracycouldattainthedemandsandtheabsoluterecoveryvalueswerealwayshigherthan90%．Thepro-posedmethodhasgoodspecificityandaccuracy.Itcouldbeusedtoanalyzethecontentdifferencesofmonoamineneurotransmittersandrelatedsubstancesindifferentmousebrainareas.Keywords

HPLC-FLD;monoamineneurotransmitter;relatedsubstances;braintissue

ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30973858)

*收稿日期基金项目

2010-03-12

*

通讯作者Tel：025－83271301E-mail：fengfang1@http://www.77cn.com.cn

国家自然科学基金资助项目（No.30973858）

高效液相色谱_荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质

368学报JournalofChinaPharmaceuticalUniversity第41卷

单胺神经递质，如去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）是中枢神经系统中非常重要的生物活性物质，它们的前体是酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp），酸性代谢产物有3，4-二羟苯乙酸（DOPAC）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）等。这些物质在正常生物体内存在动态平衡，参与中枢神经系统中多种生理过程。分析单胺递质及其相关物质可为多种疾病的诊断和治疗以及疾病机制的研究提供重要依据

［1－4］

。

高效液相色谱结合电化学检测（ECD）、荧光检测（FLD）及质谱检测是常用的分析单胺递质及其相关物质的方法，这些方法常与许多预处理技术结合，如衍生化和预浓缩。衍生化

［5－7］

过程复杂，

可能引入许多未知的副产物；预浓缩技术［7］

对不

同物质选择性不同，同时分析这类物质较为困难，且处理大量样品比较费时。ECD的电极容易被污化

［8－9］

，噪声变高，且仪器不稳定。另外，采用其他

方法（如电分析化学法），测定时易被体内共存物质干扰，灵敏度、选择性变差［10］

，改进后的方法也很难同时测定较多此类物质

［11－12］

。如果采用毛细

管电泳法分析，

由于这些物质结构相似，电泳行为相似，各物质的保留时间不稳定，也难以同时进行分析

［13］

。因此，发展一种专属、稳定、简单的方法

同时分析单胺递质及其相关物质非常必要。1材料1.1

试剂

NE、DA、5-HT（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）；DOPAC、5-HIAA（纯度≥98%，美国Sigma公司）；Tyr、Trp（纯度＞99%，上海惠兴生化试剂有限公司）；庚烷磺酸钠（纯度≥98%，美国JanssenChimica公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。1.2

仪

器

LC-10Avp高效液相色谱仪、手动进样器、柱温箱、

RF-10AXL荧光检测器（日本岛津公司）；浙江智达N2000色谱工作站；TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AB135-S电子天平（美国梅特勒-托利多公司）。1.3

动

物

雄性ICR小鼠，体重22～25g，由南京医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）

2008-0004。饲养条件：室温（25±2）℃，保持12h昼夜节律，自由饮水进食，适应环境7d。2方

法2.1

色谱条件

色谱柱：LichrospherC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：pH3.06缓冲液（含1mmol/L庚烷磺酸钠；30mmol/L磷酸二氢钠-磷酸溶液）-甲醇（85∶15）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。荧光检测：激发波长为280nm，发射波长为315nm。2.2

溶液的配制

提取液为0.1mol/L高氯酸溶液，含0.3mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用于鼠脑样本的制备。

精密称取NE、DA、5-HT适量，以提取液溶解。配制成含NE、

DA和5-HT质量浓度分别为201.9，173.2，195.5μg/mL的储备液。另取NE、DA、5-HT、DOPAC、5-HIAA、Tyr和Trp适量，分别用提取液溶解，制成标准溶液，用于色谱 …… 此处隐藏：10196字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……