高二生物基因工程知识点梳理(2)

（一）基因工程的基本工具

1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：

主要是从原核生物（微生物）中分离纯化出来的。

（2）功能：

能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：

经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端（中心轴线的两侧）和平末端（中心轴线）

EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，SmaI识别CCCGGG序列:

他们识别的核苷酸序列不同,但是切点都是在G↓C之间。

（4）比较有关的DNA酶

（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。

（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：

E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来自T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同：

DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体

（1）载体具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）运载体使用的目的：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

（3）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。它有多个限制酶切位位点，可自我复制，也可整合到染色体DNA随染色体同步复制。其上有标记基因如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等。被用做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。

（4）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。来源不同不同，结构、大小、插入片段有很大差别。

(二)基因工程的基本操作程序

目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。

2.原核基因采取直接分离（即已有物种）获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。

3.获得目的基因的方法

（一）从基因文库中获取目的基因：

基本概念的理解：

①将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

②将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。

③有些基因文库比较小，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库（用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。）

怎样提取：

根据目的基因有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体的位置，基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。

（二）PCR（即多聚酶链式反应，1988年穆里斯发明）技术扩增目的基因

（1）原理：DNA双链复制基本原理

前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。

条件：a..四种脱氧核苷酸

b.DNA的两条链为模板

c.热稳定DNA聚合酶(Taq酶）

d.一对引物（一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对） e.温度控制和缓冲液

（2）过程：

第一步：加热至90～95℃DNA解链（即热变性）

第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链（复性）；

第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）从引物起始互补链的合成（延伸）。 第四步：重复循环此过程以获得大量的目的基因。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.重组载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录停止。

（3）标记基因：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。

3.重组载体的构建方法

同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

1. 转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最

2+ 常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达

①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因

分子

检测方法——DNA分子杂交②检测目的基因是否转录出了mRNA

方法——分子杂交

③检测目的基因是否翻译成蛋白质

方法——抗原-抗体杂交

个体鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

（三）基因工程的应用<%2 …… 此处隐藏：1170字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……