荧光定量PCR技术原理与结果分析

荧光定量PCR

荧光定量PCR技术 原理与结果 分析罗喜鹏

荧光定量PCR

一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析

荧光定量PCR

一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time

Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。

荧光定量PCR

二、优越性

特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分 析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。

荧光定量PCR

三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，

RNA变异分析，溶解曲线分析等。

荧光定量PCR

四、定量方法 1.

标准曲线法的绝对定量 标准曲线法的相对定量比较CT法的相对定量

2.

3.

荧光定量PCR

五、荧光材料 荧光探针和荧光染料 ◇

SYBR green I ◇ 水解探针TaqMan ◇ 分子信标 ◇ 杂交探针

荧光定量PCR

SYBR green I未结合的SYBR green I

荧光定量PCR

水解探针TaqMan荧光素FAMTET JOE

淬灭剂TAMRADABCYL

HEXVIC

与目标序列互补

荧光定量PCR

荧光基团

淬灭剂 游离的探针

光 能量转移Taq

另一波长的荧光

光

探针与目标序列配对时 ，发生荧光共 振能量转移 (FRET) 发出荧光

Taq

延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基 团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成 荧光信号

荧光定量PCR

分子信标环(15-30bp) 环与目标序列互补

茎(5-7bp)FAM Texas Red

茎由互补配对 的序列组成

荧光基团

淬灭剂

荧光定量PCR

环光

茎淬灭剂 淬灭 DNA 模板 发出荧光

光

探针杂交到DNA模板

荧光定量PCR

杂交探针供体荧光素 受体荧光素

荧光定量PCR

六、结果分析基线(Baseline) 指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化 不大，接近一条直线，这样的直线即基线。

光域值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差 的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

荧光定量PCR

CT值

表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数。研究表明，各模板 的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之 亦

然。

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平台期 荧光阈值线 CT值 线性期 指数期

基线期

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融解曲线分析

融解温度TM

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荧光定量PCR

非特异扩增产物 目的基因产物