化学小分子探针在药物发现中的应用

化学小分子探针在药物发现中的应用

化学小分子探针在药物发现中的应用

仇文卫，汤杰

华东师范大学化学系、药物化学研究所

当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现以及靶点与活性化合物作用模式的确定，化学小分子探针在这两方面的特出优越性使其成为药物化学的研究热点。

1、 创新药物的发现、靶点与化学小分子探针

药物可以挽救生命、治疗疾病、改善健康状况、缓解痛苦和各种不适，因此，可以说药物改变着我们的生活，也影响着整个世界。然而，目前开发新药的费用平均每个高达数亿美元，尽管投入如此之高，从研发到上市仍约需10-12年之久（图1）。因此新药研发迫切需要新技术、新理论，以提高效率、缩短周期。

2～3年

2～3年2～3年

计算机药物设计年

周期长：10～12年耗资达：3.5～5.5亿美元

图1. 新药研发过程

现代药物的发现过程主要包括靶点(target)的识别、先导物的发现、结构优化、临床前及临床试验等阶段，其中正确的靶点识别是影响整个过程的关键步骤

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之一。靶点也称为受体（receptor），是指与药物分子在体内相互作用的功能性大分子，通常是某种蛋白质（绝大部分靶点是蛋白质）、核酸、离子通道或DNA等。药物分子在体内作用于靶点的特定部位，形成复合物，从而诱发生物化学及生理学上的变化，产生药物效应，达到治疗疾病的目的。若能发现这些靶点，就可以在此基础上建立相应的筛选模型，对活性化合物进行高效率的活性评价。从而促进先导物发现和结构优化的进程。可见，现今药物的发现已越来越依赖于药物靶点的发现。

那么如何解决药物靶点的发现问题呢？虽然，生命科学领域的研究近年来取得了巨大成就， 2001年人类基因组工程的完成更是一个里程碑式的进步。然而，何种蛋白质是针对某种疾病的小分子药物的靶点，在目前基因水平上的生物技术仍然无法解决。随着后基因时代的到来，人们逐渐认识到蛋白质才是生理功能的执行者，也是生命现象的直接体现者。这其中有可能蕴藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”，在基因组学基础上开展蛋白质组学研究将有可能导致药物开发方面的实质性突破。因此针对药物发现的技术重心已经由基因组转向了蛋白质组。利用化学小分子的多样性，选择适当的活性小分子，设计合成能够高选择性地探测蛋白质的功能、结构以及与活性小分子作用模式的探针——化学小分子探针，可以为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构，从而为创新药物的发现奠定基础。

在药物发现过程中，化学小分子探针主要有以下几个方面的作用（图2）：

1. 针对靶点已知的有药理活性的化合物，可以进行以下三个方面的研究：(1)了解药物分子与靶点作用部位的结构信息，为进一步的结构改造提供帮助；(2)利用探针分子研究靶点蛋白在生理与病理状态下的分布情况，深入研究蛋白质的功能；(3)利用探针分子进行细胞或体内的标记实验，可能会发现一些与活性化合物有交叉作用的靶点蛋白，从而为已知的小分子药物可能产生的毒副作用提供预测。2. 对于体内作用靶点未知，有药理活性的化合物，特别是来自天然产物的活性化合物，可以将其设计成探针分子，通过对细胞或动物的标记实验来发现其体内的作用靶点，建立新靶点的筛选模型，为先导物的结构优化服务。

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图2. 化学小分子探针在药物靶点鉴别及靶点蛋白活性位点结构信息研究中

的作用示意图

2. 化学小分子探针的设计

探针分子一般是以其母体化合物（最初的活性化合物）为基础，根据初步的构效关系设计合成的。设计的探针分子应具有适当的活性，与靶点的作用机制应与母体化合物保持一致，在不影响其活性的条件下，选择在活性分子的适宜位臵引入各个功能部位。活性化合物与靶点的作用方式主要有两种：一是活性化合物中含有某些反应基团，可以与靶点蛋白的活性部位发生反应形成共价键，因此这种结合非常稳定，是不可逆的；另一种是活性化合物与靶点蛋白通过离子键、偶极-偶极相互作用、范德华力、氢键等分子间引力相互吸引，形成复合物，这种作用相对较弱、不稳定，是可逆的。

2.1 ABPP及PAL-ABPP化学小分子探针及其功能部位

针对能与靶点蛋白形成共价作用的活性化合物设计的探针分子一般包括四个功能部位：结合基团(binding group, BG)，反应基团(reactive group, RG)、连接部位(linker unit)、报告基团(reporter group)通常也称标签(tag)。由于此类探针分子主要用于包括靶点发现在内的蛋白质功能的研究，是一种活性基于蛋白谱技术（activity-based protein profiling, ABPP）的探针分子，因此人们将这种探针分子称为ABPP探针分子(图3 A)。

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结合基团/反应基团

A:靶点蛋白

标记（共价连接）B:靶点蛋白探针分子进入活性位点紫外光照射标记（共价连接）

图3. ABPP及PAL-ABPP探针分子标记靶点蛋白

针对不能与靶点形成共价键，只能通过离子键、偶极-偶极相互作用、范德华力、氢键等分子间引力形成复合物，这种作用相对较弱、不稳定，是可逆的，因此就需要引入光亲和标记基团(photoaffinity labeling group, PAL)，其作用类似于反应基团。在探针分子与靶点蛋白形成复合物后经紫外光照射，光亲和标记基团分解产生很活泼的反应中间体卡宾，将探针分子标记(共价修饰)在靶点蛋白的活性部位，这种探针分子可称为PAL-ABPP探针分子，也包括四个功能部位：结合基团、光亲和标记基团、链接部位、报告基团(图3 B)。

2.2 结合基团

结合基团(BG)是探针分子最重要的部分，理想情况下它必须将探针分子特异性的导向处于功能状态下的靶点蛋白的活性位点，使探针分子与靶点作用，而不与环境中的其他生物分子作用。

2.3 反应基团

反应基团(RG)的作用是在探针分子进入靶点蛋白活性中心后，通过反应将

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探针分子共价修饰在靶点蛋白的活性中心，使探针分子与蛋白质的牢固连接。

2.4 光亲和标记基团

光亲和标记基团可以在紫外光照射下将探针分子共价修饰在靶点蛋白上。 通常被引入的光亲和基团包括苯基叠氮类(phenyl azides)、三氟甲基苯基双吖丙啶类(trifluoro methylphenyl diazirine)、二苯甲酮类(benzophenone)等(图4)。 N3

紫外光(254 nm)RH

苯基叠氮高活性单线态氮卡宾HNR

N3紫外光(365nm)CF3RHHCF3

三氟甲基苯基双吖丙啶

二苯甲酮

R=生物功能分子(蛋白质)~350nmPhhvO.RCHPhROH

图4. 各种光亲和标记基团的标记反应

三者之中，三氟甲基苯基双吖丙啶是最接近理想的光亲和基团。

2.6 连接部位

连接部位是连接结合基团、反应基团与报告基团的一段柔性的链状结构，它有以下两个方面的作用：在活性基团与报告基团间制造足够的空间，以避免探针分子立体结构的拥挤而保持分子活性及提高标记的效率；链接基团可以是一段直链烷烃链或多聚乙二醇链，前者有利于提高探针分子的疏水性而有利于其透过细胞膜，后者对于疏水性的探针分子来说可以增强其水溶性。

2.7 报告基团

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