土壤养分及酶活性测试方法

硝态氮的测定：《双波长分光光度法测定土壤硝态氮》，土壤肥料，2006（1）：50～52，涂常青，温欣荣。

原理：利用硝酸盐和亚硝酸盐在203nm 和230nm 波长处有较强紫外吸收峰，利用双波长系数倍数法的公式：21kA A A λλ-=?选择合适波长时，从而消除亚硝酸盐、有机质的影响。消除干扰后，硝酸盐氮的含量与A ?呈线性关系，线性范围为0～2.0L /mg ，由此建立了测定土壤硝态氮的新方法。

硝酸盐氮标准比色液：称取0.7220g 与105℃烘箱中烘干2h 干燥冷却后的3KNO 与小烧杯中，加入二次蒸馏水溶解，定量转入1000ml 的容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 的硝酸盐氮标准液。称取该溶液10.00ml 于100ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 的硝酸盐氮标准比色溶液。

亚硝酸盐氮标准比色液：称取0.1232g 2NaNO 于小烧杯中，加入二次蒸馏水，定量转入250ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为100ml /ug 亚硝酸盐氮标准溶液。称取该溶液10.00ml 于100ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 亚硝酸盐氮标准比色液。

实验方法：

1、k 系数的确定：

分别准确移取10ml /ug 硝酸盐氮使用液2.00ml 、10ml /ug 亚硝酸盐氮标准使用液2.00ml 、土壤浸提液2.5ml 置于各自的25ml 比色管中，用二次蒸馏水定容、摇匀，用1cm 的石英比色皿，以二次蒸馏水作参比，在UV -紫外可见分光光度计上在190～300nm 范围内扫描，从而确定土壤样品、硝酸盐氮的最大吸收波长203nm ，在230nm 处吸收较弱，而亚硝酸盐氮在210nm 处有最大吸收，在230nm 吸收较弱。选取203nm 、230nm 为测量波长和参比波长测定土壤中硝态氮，从而可消除样品中主要干扰组分亚硝酸盐氮的干扰。据0kA A 230203=-的公式计算，求得72.2k =。

2、标准曲线的绘制：

分别去10ml /ug 硝酸盐氮标准比色液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50ml

置于25ml 比色管中，各管加入二次蒸馏水至刻度，摇匀，用UV-紫外可见分光光度计在203nm 和230nm 处，用1cm 石英比色皿测定吸光度。用230203A 72.2A -的计算方法求得校正吸光度。

标准曲线回归方程为 0009.0x 5283

.0y -= )7n (9999

.0r == 3、样品测定：

准确称取10g 充分拌匀的鲜土壤，分别置于100ml 具塞三角瓶中，加入0.1g 4CaSO 和50.00ml 二次蒸馏水，于振荡器上振荡10min 。放置10min 后，将悬液的上部清夜用于滤纸过滤。吸取滤液1.00～20.00ml 置于25ml 比色管中，用水准确稀释至刻度，分别在203nm ～230nm 波长下测量吸光度。按下式计算土壤中硝态氮含量)kg /ug (： m /D 25)N NO (w 3ρ=-

式中，ρ为回归方程算出的N NO 3-含量，ml /ug ；

25为比色测定液总体积，ml ；

D 为稀释倍数；

m 为鲜土壤样品质量，g 。

铵态氮的测定：KCl L mol 21-?浸提-靛酚蓝比色法

1、方法原理：

用KCl L mol 21-?溶液浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的+4NH 及水溶性+4NH 浸提出来。土壤浸出液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性燃染料靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。在含氯0.05～0.51L ug -?范围内，吸光度与铵态氮含量成正比，可用比色法测定。

2、试剂：

（1）KCl L mol 21-?溶液：称取149.1g KCl 溶于水，稀释至1L ；

（2）苯酚溶液：称取苯酚（OH H C 56，化学纯）10g 和硝基铁氰化钾(O H NO )CN (Fe Na 2252?)100mg 稀释至1L ，此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，

在4℃冰箱中保存；

（3）次氯酸钠碱性溶液：称取NaOH 10g 、磷酸氢二钠（O H 7HPO Na 242?）7.06g 、磷酸钠（O H 12PO Na 243?）31.8g 和52.51L g -?次氯酸钠（NaOCl ，即含5%有效氯的漂白粉溶液）10ml 溶于水，稀释至1L ，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存；

（4）掩蔽剂：将4001L g -?酒石酸钾钠（O H 4O H KNaC 2644?）与1001L g -?的EDTA 二钠盐溶液等体积混合，每100ml 混合液中加入101L mol -?NaOH 溶液0.5ml ；

（5）2.501ml ug -?铵态氮（N NH 4-+）标准液态：称取干燥的424SO )NH (0.4717g 溶于水，洗入容量瓶后定容至1L ，制备成铵态氮（N ）1001ml ug -?的贮存溶液；使用前将其加水稀释40倍，即配制成含铵态氮（N ）2.51ml ug -?的标准溶液备用。

3、分析步骤：

（1）浸提：称取相当于20.00g 干土的新鲜土样（若是风干土，过10号筛）准确到0.01g ，置于200ml 三角瓶中，加入KCl 溶液100ml ，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡1h ，取出静置，待土壤-氯化钾悬浊液澄清后，吸取定量上层清液进行分析。如不能在24h 进行分析，用滤纸过滤悬浊液，将滤液储存在冰箱中备用。

（2）比色：吸取土壤浸出液2ml ～10ml （含N NH 4-+2ug ～2.5ug ）放入50ml 容量瓶中，用KCl 溶液补充至10ml ，然后加入苯酚溶液5ml 和次氯酸钠碱性溶液5ml ，摇匀。在20℃左右的室温下放置1h 后，加掩蔽剂1ml 以溶解可能产生的沉淀物，然后加水定容至刻度，用1cm 比色槽在625nm 波长处进行比色，读取吸光度。

（3）工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml N NH 4-+标准液于50ml 容量瓶中，各加10ml 氯化钾溶液，同（2）比色。

（4）结果计算：

土壤中N NH 4-+含量（1kg mg -?）=m

t V s ??ρ 式中：ρ—显色液铵态氮的质量浓度（1ml ug -?）

V—显色液的体积（10ml）

t—分取倍数

s

m—样品质量（g）

脲酶测定（比色法）：（《土壤微生物生态学及其实验技术》）

1、方法原理：

脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解成氨、二氧化碳和水。测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用，现介绍苯酚-次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用（在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化作用下）生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

2、试剂配制：

（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸于600ml蒸馏水中，另取295g KOH 溶于水，再将两种溶液合并，用1L

mol NaOH将pH调至6.7，并用水稀释至

/

2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮后用乙醇稀释至100ml（A液），保存于冰箱中。称取27g NaOH溶于100ml 水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9﹪，溶液稳定。（4）10﹪尿素溶液：10g尿素溶于100ml水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1ml含0.1mg N的标液，再将此液稀释至10倍制成氨工作液（0.01L

ug）.

/

3、操作步骤：

取5g风干土置于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min后加10ml10﹪尿素溶液和20ml7.6

pH 柠檬酸盐缓冲液。摇匀，37℃恒温箱中培养24h。过滤，取1ml

滤液注入50ml 容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行测定。 标准曲线配制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移至50ml 容量瓶中，然后加蒸馏水至20ml ，再加4ml 苯酚钠溶液和3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇。20min 后显色、定容。1h 内在分光光度计上于波长578nm 处比色，根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。

3、结果计算：

以24h 后1g 土壤中N NH 3-的质量（mg ）表示脲酶活性（re U ）： re U =m /n V a **

式中：a 为由标准曲线求得 …… 此处隐藏：12005字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……