细胞内p53蛋白LC_MS_MS定量方法及其应用_李盈淳

来源：网络收集时间：2026-10-01

导读：学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2012，43（6）：519－525 519 细胞内p53蛋白LC-MS/MS定量方法及其应用郝海平李盈淳，汤志远，吴梦秋，王广基， * ＊＊（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京210009）摘要 MS/MS定量方法，建立细胞样

学报

JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2012，43（6）：519－525

519

细胞内p53蛋白LC-MS/MS定量方法及其应用

郝海平李盈淳，汤志远，吴梦秋，王广基，

＊＊

（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京210009）

摘

要

MS/MS定量方法，建立细胞样品中p53蛋白的LC-应用该定量方法测定放线菌素D作用下细胞中p53表达

量的变化。采用免疫沉淀法提取细胞样品中的p53蛋白，对提取后的样品进行酶解，基于肽图分析选择特异性肽段VEY-2+

LDDR（m/z455.22+-681.21+）作为定量肽段，695.21+）作为内标肽段，设计合成肽段VEYIEDR（m/z462.1-建立该肽段的

LC-MS/MS定量方法，通过该肽段表征p53蛋白的量；应用该质谱定量方法对放线菌素D给药后的HCT116细胞中的p53

蛋白的表达量进行测定。p53蛋白质谱定量方法学考证表明，方法的线性良好（R=0.9993），范围2.2～112.3pmol/mL；

专属性好，基质中无干扰成分，批内批间精密度及稳定性均符合生物样品的测定要求；放线菌素D给药后细胞中p53蛋白MS/MS定量方法可以准确的测定细胞内的表达量呈给药浓度与给药时间依赖性增加。建立的细胞样品中p53蛋白的LC-的p53蛋白表达量。

关键词

p53；LC-MS/MS；放线菌素D；定量

R917

文献标识码

文章编号1000－5048（2012）06－0519－07

中图分类号

Quantificationofp53proteinusingliquidchromatographytandemmassspec-trometryincellsanditsapplication

LIYing-chun，TANGZhi-yuan，WUMeng-qiu，WANGGuang-ji*，HAOHai-ping＊＊

KeyLaboratoryofDrugMetabolismandPharmacokinetics，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China

AbstractAnabsolutequantificationmethodwasdevelopedtoquantitativelymeasurep53proteinusingLC-MS/MSfordetectionofaselectivetrypticpeptide.AtrypticpeptideVEYLDDR(m/z455.22+-681.21+)was

selectedoftheimmunoprecipitation-enrichedsamplesofp53proteinfollowingproteolysiswithtrypsin，anda

syntheticpeptideVEYIEDR(m/z462.12+-695.21+)wasdesignedastheinternalstandard．Quantitativedeter-minationofp53proteinchangesbytheeffectofactinomycinD.Thelowerlimitofquantificationwas2.2pmol/mLwiththelinearityofthestandardcurvespannedto112.3pmol/mL(R2=0.9993).Boththeaccuracy(rela-tiveerror)andtheprecision(coefficientofvariation)ofthemethodwerebelow15%．Thismethodwassuccess-fullyappliedtodeterminetheabsoluteamountofp53inHCT116cellsbytheeffectofactinomycinD．Thep53expressionwasincreasedovertimeanddrugconcentration.Thedevelopedmethodcouldbedirectlyapplicabletomanycurrentresearchneedsrelatedtop53protein.Keywords

p53;LC-MS/MS;actinomycinD;quantification

ThisStudywasSupportedbyChinaNationalKeyHigh-TechInnovationProjectfortheR＆DofNorelDrugs(No．2009ZX09304-001)

p53蛋白是至今发现与人类肿瘤相关性最高的蛋白，也是目前公认的与人类关系最为密切的抑癌基因，在人类肿瘤的发生发展及机体组织细胞的

［1］

生长发育分化等过程中起重要作用。由于其在

05-10收稿日期2012-基金项目

*＊＊

细胞周期调控、抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、

肿瘤治疗等方面的重要作用，故被称为“基因组卫

［2］

士”。p53蛋白在转录调控中起到重要的作用，通过阻断细胞周期的进程参与损伤DNA的修复过

*通讯作者Tel：025－83271128Tel：025－83271179

E-mail：guangjiwang@http://www.77cn.com.cnE-mail：hhp_770505@http://www.77cn.com.cn

“重大新药创新”001）国家科技重大专项资助项目（No．2009ZX09304-

520学报JournalofChinaPharmaceuticalUniversity第43卷

程，在发生不可修复的损伤时，启动细胞的凋［3］

亡。现有的p53的定量方法主要是免疫分析法，例如Westernblot和酶联免疫吸附（ELISA）方法，尚未见质谱定量方法。免疫分析方法存在特异线性范围较窄等缺点。随着液相色谱技术性较差、

LC-MS和质谱技术以及生物样品分离技术的发展，定量技术在蛋白质的定量研究中应用日益广泛，一

［4－5］［6－7］

、些多肽及蛋白质药物药物代谢酶和药物转运体

MS绝对定量方法被建立和应用。的LC-LC-MS相对于传统的免疫分析方法（例如ELISA），定量技术提高了分析方法的精密度和准确度。其最大的优点在于通过液相色谱的分离和质谱的选择性将结构和化学性质相近的多肽和蛋白质进行

了分辨，减少了相似结构相似化学性质的多肽和蛋白质的相互干扰，提高了样品定量的特异性，避免

［9］

了基质的干扰。

由于p53在细胞命运中的重要作用，对于细胞中p53表达量的的研究具有重要的意义，本文以免选择p53蛋疫沉淀法提取细胞样品中的p53蛋白，

MS/MS定量方法，白的特异性酶解肽段建立其LC-Act-D）作用并应用于放线菌素D（actinomycinD，

下细胞中p53表达量的测定。１1.1

材

料

［8］

谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst1.3数据处

理软件。ABSCIEXTripleTOF5600型四极杆飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst1.3数据处理软件。２2.1

方

法

p53蛋白细胞样品提取方法的建立2.1.1HCT116细胞和H1299细胞的培养

人结

5%CO2的环境肠癌细胞HCT116培养于37℃、

中，培养液为McCoy's5A培养基，含10%胎牛血清（FBS）、青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL。细胞长至60%～70%时需进行传代。

5%CO2人肺腺癌细胞H1299培养于37℃、

的环境中，培养液为DMEM培养基，含10%FBS、青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL。细胞长至60%～70%时需进行传代。2.1.2

样品提取柱的制备取重组蛋白A琼脂糖

凝胶100μL加入离心柱中，冷冻离心（3000r/min，

1min）去除溶剂；用0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.0）冲洗树脂2次；加入用磷酸钠缓冲液稀释的p53抗体（DO-1），4℃混悬过夜使抗体与树脂充

分结合；0.2mol/L三乙醇胺缓冲液（pH8.2）冲洗2次，每次5min；加入20mmol/LDMP0.2mol/L三乙醇胺缓冲液（pH8.2）重悬含有抗体的HCl缓冲蛋白A琼脂糖凝胶1h；0.1mol/LTris-液（pH7.6）冲洗1次后重悬蛋白A琼脂糖凝胶，准备上柱。

2.1.3细胞样品中p53蛋白提取方法人结肠癌细胞HCT116培养至80%，用PBS清洗细胞3次，再将细胞刮下，收集细胞，加入NP40细胞裂解液裂解后测定蛋白浓度，用裂解液将其稀释至蛋白浓度为2.5mg/mL；总蛋白浓度为2.5mg/mL的H1299细胞裂解液加入p53蛋白标品配制成含一定p53蛋白浓度的细胞裂解液。取上述细胞裂解液200μL，加入上述的样品提取柱，室温混悬30min，然后4℃放置1h，离心去除细胞裂解液，1mol/LNaCl清洗1次，加入PBS清洗3次，最后加入6mol/L盐酸胍400μL洗脱蛋白。洗脱后的蛋白根据上述的p53蛋白的酶解方法对洗脱的蛋白样品进行酶解，酶解后加入20%甲酸终止反应，并加入终浓度为5ng/mL的合成肽段内标后进行p53蛋白的定量分析。

试剂和细胞GST-p53融合蛋白（100μg/mL）、Histag-p53

融合蛋白（2.27nmol/mL）（美国Millpore公 …… 此处隐藏：12599字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……

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