微生物大小的测定及显微镜直接计数法

微生物大小和数量的测定

一、目的要求

1． 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。 2． 增强微生物细胞大小的感性认识。

3． 了解血球计数板的构造、明确其计数原理。

4． 学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。

二、基本原理

l.显微测微尺

显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。目镜测微尺（图1）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺每小格的长度.

两重合线间镜台测微尺格数×10

目镜测微尺每格长度（μm）=

两重合线间目镜测微尺格数

2.表示方法

球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8µm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3µm。

图1：目镜测微尺和镜台测微尺

3．显微直接计数法：

将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌

孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 4. 血球计数板

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。本实验选用为25×16的血球计数版。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：

A

1mL菌液中的总菌数= 5×25×104×B=5×104×A·B （25个中格）

三、实验器材

1、菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）24h马铃薯斜面培养物 2、溶液与试剂

0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水。 3、仪器及其他用品

目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸；血细胞计数板、移液管，小玻璃珠，烧杯，锥形瓶等

四、操作步骤

1． 微生物大小的测定。 （1） 目镜测微尺的安装 如图2取出接目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，使有刻度的一面朝下，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内

图2：目镜测微尺的校正及安装 （2）校正目镜测微尺

①放镜台测微尺

将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。

②校正 先用低倍镜观察，将镜面测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数（图2）用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头

③计算

由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm）=

两重合线间镜台测微尺格数×10

两重合线间目镜测微尺格数

（3）菌体大小的测定 ① 制作酵母水浸片

接种酵母菌→玻片中央滴一滴美蓝→盖盖玻片

② 目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到标本后再测定。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。分别测出菌体在10倍，40倍和油镜（100倍）下的宽度和长度格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。

③ 将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。

同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，选取有代表性的3个菌体进行测量和计数，每个菌体测三次。然后计算取平均值。 ④ 测定完毕取出目镜测微尺后将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。

2． 显微镜计数。

（1）血球计数板清洗。并自然干燥。 （2）菌悬液制备

对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1mL到试管中，用移液管移取9mL水注入试管中。再取上一次稀释的菌液中的1mL加到另一支试管中，加9mL水。依此类推。即可得到一系列稀释梯度的菌液。 镜检计数室

（3）在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

（4）加样品。将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先

要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。 （5）显微镜计数。加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有不多于8个个菌体。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，芽体全不计。 （6）清洗。

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净， …… 此处隐藏：2137字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……