10呋喃唑酮快速检测试剂盒说明书

呋喃唑酮代谢物（AOZ）快速检测试剂盒说明书

2010-01版

一、 原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的AOZ，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的AOZ和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的AOZ含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃唑酮代谢物含量。 二、 试剂盒技术指标： 试剂盒灵敏度： 0.05ppb 样本检测下限：

组织（鸡/鸭/猪/牛/羊/鱼/虾肉）—---——0.1ppb 肝脏（鸡/鸭/猪/牛/羊肝脏）--------———0.1ppb 蜂蜜、牛奶、肠衣--------------------------—0.1ppb 鱼/虾等水产品组织因存在一定的干扰， 检测下限为0.2ppb 交叉反应率：

呋喃唑酮代谢物————————————100% 呋喃它酮代谢物———————————﹤0.1% 呋喃妥因代谢物———————————﹤0.1% 呋喃西林代谢物———————————﹤0.1% 回收率：

组织、肝脏……………………………90%±10% 蜂蜜、牛奶、肠衣……………………75%±15% 三、试剂盒组成

1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条 2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、

0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 酶标记物 12ml………………………红色帽 4、 抗体工作液 7ml………………………蓝色帽 5、 底物A液 7 ml………………………白色帽 6、 底物B液 7 ml………………………黑色帽

7、 终止液 7 ml………………………黄色帽 8、 20X浓缩洗涤液40 ml…………………白色帽 9、 2X浓缩复溶液 50 ml…………………透明帽 10、衍生化试剂 10ml …………………白色帽 四、 所用仪器、试剂

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮

气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多

道250µl

试 剂：

氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾（所有样本使用）

亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）、 ZnSO4·7H2O（奶样专用） 五、样本前处理步骤 样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、

禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。

（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的

试剂时要更换吸头。 （c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要

时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理需配制：

配液1: 用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1 稀

释，用于提取后的样本复溶

配液2: C液：（供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化

钾用去离子水定溶至100ml。

D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去

离子水溶解定溶至100ml。

配液3: 0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O

加去离子水溶解定溶至1L

配液4: 1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。 配液5：1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。 样本的处理方法： (a) 奶样

1、 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C

液和D液各250µl。

2、 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机

4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。

3、 接(b)的描述方法

(b) 组织、蜂蜜、肠衣、肝脏

1、 取1±0.05g的均质样本(组织、蜂蜜、肠衣、

肝脏)，牛奶的离心上清液1.1ml（相当1ml

奶样），分别加入4ml的去离子水，0.5ml1M

HCl和100µl衍生化试剂，充分振荡。

2、 置于37℃过夜孵育（大约16h）或56℃水浴中

孵育(2h)；

3、 分别加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M

NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振荡5min；

4、 在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心

10min。

5、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中

于50℃氮气/空气吹干。 6、 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释 好的复溶液充分混合30s；在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心10min。 7、 取50µl下层相用于分析。 样本稀释倍数：2 六、酶标免疫分析程序 1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去

离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。 4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每

个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后

加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应1h。 6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5

次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 7、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃

环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 8、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色30min。 9、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定

每孔OD值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方

法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与AOZ

的含量成负相关。 1、粗略判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AOZ浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，

标准液吸光度值分别是：0ppb为1.671；0.05ppb为1.425；0.15ppb为1.103； 0.45ppb为0.567； 1.35ppb为0.205； 4.05ppb为0.104。则样品1

的浓度范围是0.45ppb-1.35ppb；样品2的浓度范围是0.05ppb-0.15ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝ B

B×100%

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以AOZ标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。 八、注意事项

1、 用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。 2、 用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。 3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于

洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。

4、 …… 此处隐藏：1998字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……