组织化学技术5-免疫组化

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第三章 免疫组织化学前言免疫组织化学(Immunohistochemistry) 免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织 内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原 位检测技术。

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1.发展简史 ——1941年 ——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检 首先用荧光素标记抗体— 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 —— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁 蛋白标记Ab技术。 蛋白标记Ab技术。 —— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立 70年代 辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶(PAP 辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶(PAP )技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。

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—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素(ABC) 80年代 等建立了抗生物素—生素(ABC) 法之后，免疫金— 法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世。 —— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 90年代 胞化学分类方法迅速发展。 ——2000年 ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综 合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各 个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基 本技术之一。

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2.免疫组织化学的技术分类(1)根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 (2)根据Ag—Ab结合方式分成： )根据Ag—Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法

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(3)按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术(免疫荧光法) ② 免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD 免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法) ABC法) ③ 免疫金属技术(免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A 染色法、蛋白A金法) 3.标记物 (1)必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。

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(2)常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素(Fluorescein 素(Fluorescein isothiocyanate , FITC) FITC) —— 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明(rho—damine RB200) 四乙基罗达明(rho— RB200) ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：(Biotin) 生物素：(Biotin) ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素(因涉及污染和防护 难一般不用)

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4.应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如 肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、 表面抗原等等均可用免

疫组织化学方法显示， 因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最 终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法 对所研究的大分子分子进行定位，进而深入 研究其功能。

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一、免疫组织化学技术(一)染色方法 1.直接法 荧光素直接标记特异性抗体(— 荧光素直接标记特异性抗体(—抗) 上，标记抗体与抗原结合(在切片上) 荧光显微镜下观察→ 荧光显微镜下观察→检测抗原。 △ 酶标抗体要显示后镜检。

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直接法优点：简单，时间短，特异性强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大(不经济)。 应用：基本不用了！!

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2.间接法 荧光素标记在二抗上(二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体)。※显色后镜检 IgG抗体)。※ 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。

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3.非标记Ab桥法： 非标记Ab桥法 桥法：“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗 体， 其二抗为未标记桥抗体。 (1)单桥法

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(2)双桥法 (2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系 4.PAP法(过氧化物酶—抗过氧化物酶法 PAP法 过氧化物酶—Peroxidase anti—peroxidase method, PAP法) anti— method, PAP法)

~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→ 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 抗体— IgG抗体—PAP复合物。

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该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度， 标本可长期保存。 标本可长期保存。 5.ABC法(亲和素—生物素—过氧化物酶复 ABC法 亲和素—生物素— 合物法，Avidin—biotin—peroxidase 合物法，Avidin—biotin— Complex method,ABC法) method,ABC法 Avidin: 亲和素，一种糖蛋白，其上有4 Avidin: 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin : 生物素—维生素H,两者亲和力巨 生物素—维生素H 大，牢不可破。

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ABC法与 ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代 法与PAP法的区别是 法的区别是： ABC复合物代 替PAP复合物。 PAP复合物。(1)ABC复合物的制备： ABC复合物的制备：