免疫组织化学常用技术方法大全

涵盖了几乎所有常用免疫组化的技术方法

免疫组织化学常用方法大全基本原理与操作步骤

涵盖了几乎所有常用免疫组化的技术方法

第一节

免疫酶细胞化学

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免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法， 最常用的方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下， 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质(抗原/抗体) 学手段，检测某种物质(抗原/抗体) 在组织细胞内的存在部位。 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结(酶标抗体),再使其与组 体与酶连结(酶标抗体),再使其与组 ), 织内特异性抗原反应， 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。 在光镜或电镜下观察分析。

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一、常用酶的种类 用于标记的酶应具备以下几点： 用于标记的酶应具备以下几点： 酶催化的的底物必须是特异性的， ● 酶催化的的底物必须是特异性的，且 容易被显示， 容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电 镜下观察。 镜下观察。 所形成的终产物沉淀必须稳定， ● 所形成的终产物沉淀必须稳定，不向 周围组织弥散。 周围组织弥散。 较易获得酶分子，最好有商品出售。 ● 较易获得酶分子，最好有商品出售。

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中性pH时 酶应稳定， ● 中性 时，酶应稳定，酶标记抗 体后，保存 年活性不应改变。 体后，保存1~2年活性不应改变。 年活性不应改变 酶标过程中，酶与抗体连结， ● 酶标过程中，酶与抗体连结，不 能影响二者的活性。 能影响二者的活性。 被检测组织中， ● 被检测组织中，不应存在与标记 酶相同的内源性酶或类似物质。 酶相同的内源性酶或类似物质。

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免疫组织化学常用酶 ——————————————————— 名称 分子量 内源性 商品

——————————————————— HRP (POD) 40-50 kD ALP (AP) 80-120 kD + ++ 有 有

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● HRP/POD(辣根过氧化物酶) (辣根过氧化物酶)显色原理： 显色原理： HRP + H2O2 体) HRP + H2O + 供氢体 (氧化 型) HRP · H2O2 + 供氢体 (电子供

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DAB(二氢基联苯胺) (二氢基联苯胺) AEC(3-氢-9-乙基咔唑) ( 氢 乙基咔唑 乙基咔唑) TMB(四甲基联苯氨) (四甲基联苯氨)

棕褐色 红色 深蓝色

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● ALP/AP(碱性磷酸酶) (碱性磷酸酶) 底物：萘酚( 底物：萘酚(As-Mx) ) 发色团：Fast Blue 发色团： Fast Red BCIP/NBT

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血细胞、 血细胞、淋巴细胞 内源性过氧化酶含量较高 可选用ALP/AP 可选用

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二、染色步骤及原理

间接法： 间接法：1. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水; 2. 未固定的冰冻切片，丙酮固定 20~30 未固定的冰冻

切片， min,风干15~30min; ,风干

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3. 用0.03%H2O2处理切片15~30 min(室温), 封闭内源性过氧化酶的活性； 4. PBS洗涤2min; 5. 0.05% Tween-20/PBS,5min(室温); (微波修复抗原、蛋白酶消化)

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6. 0.1%-1% BSA湿盒内孵育 ~25 min 湿盒内孵育15 湿盒内孵育 (室温),然后轻轻弃去孵育液(不冲洗) 室温),然后轻轻弃去孵育液 不冲洗) ), ;(或二抗动物的正常血清 或二抗动物的正常血清); 或二抗动物的正常血清 7. 轻轻弃去孵育液，滴加PBS稀释的第 轻轻弃去孵育液，滴加 稀释的第 一抗体，湿盒内孵育 一抗体，湿盒内孵育1~2 h (20-25℃); ℃ 8. PBS充分冲洗， 5min × 3次，以去 充分冲洗， 充分冲洗 次 除切片上非特异性吸附的抗体； 除切片上非特异性吸附的抗体；

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9. 滴加 滴加PBS稀释的 稀释的HRP标记的第二抗体， 标记的第二抗体， 稀释的 标记的第二抗体 湿盒内孵育45 室温); 湿盒内孵育 ~60 min (室温); 10. PBS漂洗 5min × 3 次； 漂洗 11. 显色，0.01% - 0.1% H2O2 / 显色， 0.01% -0.05% DAB, 10~15 min; ; 12. 细胞核复染(甲基绿或苏木素); 细胞核复染(甲基绿或苏木素); 13. 封片、观察、记录。 封片、观察、记录。

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亲和组织化学( 亲和组织化学(affinity histochemistry) ) 植物凝集素与糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与 葡萄球菌 蛋白与IgG 蛋白与 阳离子与阴离子 激素、维生素、 激素、维生素、糖类与受体

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第二节抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法 抗生物素 生物素免疫细胞化学染色法