ProteinASepharose4FF产品使用说明书

Protein A Sepharose 4FF 产品使用说明书

——高IgG结合特异性高流速低蛋白A脱落

产品特点

特点结合特异性强，基

颗粒大小50-160 μm

团脱落少

推荐流速50-300cm/h

基质4%的交联琼脂糖

凝胶

配基重组protein A 使用温度常温

pH范围3-10

配基密度6mg重组蛋白

A/ml

动态吸附载量60mg人IgG/ml 保存温度+4~8℃

保存液体20%乙醇

蛋白A残留小于3ng蛋白

A/mg IgG

产品介绍

Protein A sepharose介质是经过我们公司长期开发，在公司生产的native protein A 的基础上精致而成。通过Protein A Sepharose 4FF，可分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。本产品相对同类产品具有如下优势：

1、偶联条件温和，更好的保持了protein A的构象，所以抗体载量高，同体积的介质，相同规模的纯化设备，相同体积介质，抗体的产量明显高于用同类产品，大大的降低了抗体药物生产成本。

2、非常稳定，不易脱落，用其生产的抗体中protein A的残留比同类产品的更少。

3、公司的Protein A 以及Protein A sepharose的生产都是在清洁车间生产，符合制药企业生产需求。

4、公司生产的Protein A sepharose使用寿命长，常规条件下能够重复使用100次以上。

使用说明

（1）缓冲液的准备：

平衡缓冲液：纯化不同动物和不同亚型抗体

平衡缓冲液成分

时所用平衡缓冲液是不同的，部分参照如

下：抗体种类

人IgG1、人IgG2、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b 10mM 磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH

7.21

人IgG3、人IgG4、小鼠IgG1、大鼠IgG3 50mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5

（2）样品的准备

样品上柱前先用平衡缓冲液稀释5至10倍，从而确保样品液的成分和pH与平衡缓冲液相近。如果上样体积过大，可以采取调节上样液pH和盐浓度的方式，使样品的pH和电导与平衡液接近，使样品中的缓冲体系与平衡缓冲液相同。

细胞培养液中大量的血清蛋白会对亲和层析造成一定的干扰，去血清处理或稀释样品将提高纯化抗体收率。

样品在上柱前也需0.45μm微孔滤膜过滤。

（3）操作步骤

a) 填料装柱后，用纯水流洗至少3个柱管体积，以冲掉乙醇，再用平衡缓冲液流洗至少5个柱管体积来平衡柱子。

b) 将样品上柱，上样流速控制在60cm/h。

c) 平衡缓冲液再洗5-10个柱床体积，把UV洗至基线。

d) 洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，立即用中和缓冲液中和到中性。

e) 再生缓冲液流洗3-5个柱床体积。先后用纯水、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。柱子置于+4-8℃保存。

操作中如果没有在线的蛋白监测系统，洗脱峰时可以分阶段

收集，最后根据测定结果合并活性部分。

应用范例

从人血浆中纯化IgG：

图1 为应用本公司产品分离人血浆中的IgG 的分离纯化色谱图。SDS-PAGE 电泳分析结

果见图2。

填料：Protein A Sepharose 4FF，装柱体积1mL；样品：人血浆，pH7.24；平衡缓冲液：10mM PBS，pH 7.21；洗脱缓冲液：0.1M Gly-HCL，pH3.0；洗脱蛋白量：55.9mg

图1 分离人血浆中IgG 色谱图

M 泳道：蛋白Marker；R 泳道：人血浆；1 泳道：洗脱人IgG

图2 SDS-PAGE 电泳结果分析

亲和力抗体亲和力

表1 Protein A 对

不同物种抗体的

特异性抗体

人 IgG1 ++ 山羊+

人 IgG2 ++ 豚鼠++

人 IgG3 –绵羊–

人 IgG4 ++ 狗++

兔++ 猪++

牛+ 大鼠+

马–小鼠–

++：强；+：中等；-：弱。

亲和力平衡缓冲液pH值洗脱缓冲液pH值表2 Protein A 与

哺乳动物抗体的结

合程度抗体

人

IgG1 very high 6.0–7.0 3.5–4.5

IgG2 very high 6.0–7.0 3.5–4.5

IgG3 low to none 8.0–9.0 <7.0

IgG4 very high 7.0–8.0 3.0–6.0

小鼠

IgG1 low 8.0–9.0 5.5–7.5

IgG2a moderate 7.0–8.0 4.5–5.5

IgG2b high ≈7.0 3.5–4.5

IgG3 low to high ≈7.0 4.0–7.0

大鼠

IgG1 very low 3.9 7.0–8.0

IgG2a low to none 39.0 <8.0

IgG2a low to none 39.0 <8.0

IgG2c very low 8.0–9.0 <7.0

不同物种的抗体与Protein A的结合强弱程度是不同的（见表1），因此纯化过程中选用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液也有所不同（见表2）。用户可以通过调高平衡缓冲液中的盐浓度和pH来增加抗体与A蛋白的吸附力。

注意：抗体与蛋白A结合强度的强弱并不直接代表纯化效果的好坏。

注意事项

1、介质从冷室或冰箱中取出后最好在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产生气泡影响柱效。

2、装柱时尽可能维持长径比为5：3～2：1，长径比过大将导致洗脱峰拖尾，洗脱体积增大；长径比过小将导致样品与填料接触时间短，吸附不充分，填料吸附蛋白量小。

3、若上样液中抗体浓度过高，应使用平衡缓冲液稀释至1~2mg/ml，以免上样浓度过高影响柱效。

4、可以采用降低上样时的流速来增加样品与填料接触时间从而提高纯化抗体量。对于5ml Protein A Sepharose 4FF预装柱来说，通常的上样速度为2ml/min，出于考虑增加样品与填料接触时间的因素，可以把上样流速降低到1ml/min。

5、凝胶用低pH缓冲液洗脱时间应尽可能短，洗脱后用中性缓冲液尽快洗到pH中性，以延长亲和介质的使用寿命。

6、洗脱后，应立刻用如中和缓冲液将收集到的抗体溶液中和到中性（pH7.4左右），以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。

7、通常使用后应用0.1M柠檬酸钠缓冲液（pH3.0）做再生处理，然而长期采用极端的洗脱条件将缩短亲和介质的使用寿命。本公司生产的Protein A Sepharose 4FF仿生亲和介质杂质吸附较少，可适当减少再生处理的频率，每使用5次再生1次即可。

8、本产品保存条件为20%乙醇，+4~8℃。