反向遗传学操作技术在禽流感研究中的应用

中国动物检疫2011年第28卷第3期

专论综述·

-75-

本栏目主持人:袁丽萍

ylp652@http://www.77cn.com.cn

反向遗传学操作技术在禽流感研究中的应用

靳冬1，吴志明1，张志凌1，张健1，李明义2，赵雪丽1

（1.河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州

摘

450008；2.山东信得科技股份有限公司，山东青岛266032）

要：反向遗传操作技术的建立为负链RNA病毒的研究开创了新的途径，使负链RNA病毒的许多特性得以深入认识。

禽流感近年在全球的广泛暴发，使得对流感病毒的深入研究更加迫切，反向遗传操作技术的应用，使禽流感病毒的基因结构、致病机理、与宿主细胞的相互关系等各方面的研究工作都取得了巨大进步。笔者就国内近几年反向遗传操作技术在禽流感研究中取得的进展做一综述，并对该技术的发展趋势做一分析，提出对策思考。

关键词：反向遗传操作技术；禽流感；发展趋势；对策思考中图分类号：R392-33

文献标识码：C

文章编号：1005－944X（2011）03－0075－03

1流感病毒反向遗传技术发展概况

RNA病毒的反向遗传操作技术（reversegenet-）是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在ics

病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作，以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究，以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等[1]。它解决了对RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题。从cDNA克隆拯救出负链RNA全病毒是20世纪90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一，它开启了人们对病毒基因组进行人工操作和详细了解病毒基因及其产物功能的大门，该技术的迅速发展，引起了国内外研究者的极大关注[2-6]。

流感病毒为分节段、单股负链RNA病毒，对其

通讯作者：吴志明

分子生物学方面深入的研究，是在1989年由Luytjes等人创立了流感病毒反基因操作技术之后才得以实流感病毒反基因操作技术的突破性进展完成于现的。

1999年，Neumann等圆满地完成了对流感病毒的反基因操作工作，他们完全用质粒DNA转染细胞，利用细胞中的转录和翻译机制，得到了具有感染性的、完整的流感病毒。在Luytjes等人首次对流感病毒进行基因组操作近10年之后，病毒学家最终获得了对流感病毒进行复杂而深入研究的有利工具，可以研究流感病毒蛋白和RNA因子在病毒复制和致病性方面的各种特性。

2000年，在流感病毒反基因操作技术方面又取得了重大的进展。ErichHoffmann等人将Neumann等人和ErvinFodor等人于1999年完成的，需12~17个质粒共转染细胞获得活病毒的反基因操作技术减病毒少到仅需8个质粒进行共转染。在这一系统中，

全隐患。对比日本入境伴侣动物检疫制度，就完善我国入境伴侣动物检疫监管工作，得到以下启示。2.1

采用电子身份芯片植入和识别技术

对进入我国的伴侣动物须植入符合ISO11784和

ISO11785标准的电子身份芯片，未植入电子身份芯片的伴侣动物一律不得进入。同时，在入境口岸现场配备符合国际标准的电子身份芯片检测仪器，以提高现场查验工作的有效性、科学性、准确性和快捷性，为全面了解动物既往史及后续检疫监管提供依据。2.2建立官方隔离检疫场

根据我国实际情况和条件，在某些入境口岸建立官方入境伴侣动物隔离检疫场，集中对入境伴侣动物

对从未建有官方隔离检疫场的实施隔离检疫和监管。

口岸入境的伴侣动物，口岸查验合格后，全部调离到

官方隔离检疫场实施隔离检疫。2.3

加强实验室建设和检测

对入境伴侣动物进行临床检查，固然可检查出一些显性感染的病例，但隐性感染病例，则很难凭临床

检查发现，因此，有必要加强实验室检测。统一对入境伴侣动物检测实验室实施布局，确保各口岸直属检验检疫局有一初筛实验室，全国设若干确诊实验室。对隔离检疫的入境伴侣动物，按规定开展相关疫病检测，以防范外来疫情疫病的传入。参考文献：

[1]周俊平，何卫筠，邓海.入境伴侣动物检验检疫监管措施研究[J].检验检疫科学，2008，18（5）：74-77.

[2]郭明星.动物疫病流行趋势与出入境动物检疫对策[J].动物医学进展，2005，26（1）：112-115.

-76-

专论综述·

中国动物检疫2011年第28卷第3期

cDNA被插入在polⅠ启动子和终止子序列之间，而完整的polⅠ转录单元的两侧分别是polⅡ启动子和polyA序列。这2套转录单位就使得从一个病毒

cDNA模板上可以同时合成负链病毒RNA和正链mRNA，并以此为基础，利用宿主细胞的复制、转录机制，产生并释放出具有感染性的流感病毒颗粒[7]。2反向遗传操作技术在高致病性H5N1亚型流感上的应用

2.1病毒粒子的拯救李泽君等利用8质粒系统成功拯救了Goose/Guangdong/1/96病毒株（R-GS-GD/1/96），拯救后测序与原病毒株基因序列完全一致。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒（W-GSGD/1/96）一致的生物学特性，即对鸡都是高致病性毒株，R-GSGD/1/96与W-GS-GD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10。GS-GD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础[8]。2.2

致病机制及生物学特性研究Li等以从我国南方鸭中分离到的2个H5N1亚型禽流感病毒为模型，利用反向遗传操作系统，首次发现流感病毒PB2基因上的701位氨基酸由D变为N时，可使不能感染哺乳动物的H5N1亚型禽流感病毒获得感染和致死哺乳动物的能力，部分阐明了H5N1亚型高致病性禽流感病毒跨越禽/哺乳动物种间屏障的遗传变异机制[9]。

2.3流感疫苗株的构建Liuming等利用反向遗传学技术构建减毒的H5N3疫苗株，其H5基因来源于A/Goose/HK/437/99（H5N1），同时将其HA基因裂解位点的氨基酸序列缺失，N3基因来源于A/Duak/Ger-many/1215/73（H2N3），其他6个基因来源于A/PR/8/34（H1N1）。实验证明该毒株在鸡胚中能大量扩增，以此病毒制成疫苗，免疫鸡能诱导产生高滴度的HI抗体，并且能抵抗致死量野型株H5N1型病毒的攻击[10]。Subbarao等也利用反向遗传学技术将高致病性的H5N1病毒株德HA基因裂解位置的序列（H1N1）的基因替换，改变，把内部基因用A/PR/8/34最终得到的病毒株制备的疫苗，能保护小鼠抵抗致死量野型株H5N1型病毒的攻击，制成灭活苗能保护小鼠对野生型H5N1病毒的攻击，而阻止H5N1强毒在鼠肺中的复制[11]。

卢建红等利用A/Goose/Huadong/1/2000（H5N1）（缩写为Gs/Hd/00），A/Chicken//Shanghai/F98（H9N2）（缩写为C/SH/F/98）2株病毒，将H5N1亚型禽流感病毒（AIV）缺失其HA基因裂解序列的4个碱性氨基酸，使HA裂解模式由高致病性的PQRERRRKKR↓GL突变为低致病性的PQRESR↓GL，将修饰的

HA基因克隆入转录/表达载体pHW2000，构建质粒pHW524-HA，将该毒株和H9N2亚型毒株的NA全基因分别克隆入pHW2000，构建质粒pHW506-NA

和pHW206-NA。将pHW524-HA与pHW506-NA或pHW206-NA组合均用A/WSN/33（H1N1）提供的6个内部基因、2个组合的8个质粒分别共转染COS_1细胞，产生了H5N1和H5N22个亚型的基因重排病毒。通过在鸡胚中的连续传代和适应，2个重组病毒血凝价上升到1:29，表面基因稳定，对6周龄SPF鸡不表现致病性，H5N2重组病毒对鸡胚的毒力低于H5N1病毒。这种尝试证明反向遗传操作 …… 此处隐藏：5783字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……