动物细胞培养技术实验指导(全面)

实验篇

实验一 实验器材的清洗

实验物品

（一）每一大组公用物品（每班分6大组）

吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。

（二）每一小组公用物品（两人一小组）

刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶 及塞子4个、l0毫升盐水瓶 及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。

（二）公用物品

小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双 、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。

清洗注意事项和要求

（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。

（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。

（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。

（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。

（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2

盆。

（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者

可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。

（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等

引起二次污染。

（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。

操作方法

（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法

常用清洁液配方

重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。

以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水

8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。配好后倒入洗液缸中备用。新配制的清洁液呈棕红色。当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。

（二）物品的清洗

1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤

清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂

中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。

2、用过的玻璃器皿清洗步骤

带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→

刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。

3、橡皮帽和橡皮塞的清洗

新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下；

2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．

4、塑料制品（塑料培养板、针头式加压塑料小滤器）的清洗

用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干

→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。

5、不锈钢除菌滤器的清洗

先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡

24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。

6、镊子、剪刀

纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。

7、金属滤网

自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。

实验二 实验器材的包装和消毒

实验用品

实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌

操作台一台/组、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。

实验方法

（一）包装

1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。

2、瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸包扎。随后单个或几个一起用纸包好。

3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，吸管、滴

管，随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内（内放纱布），塞上棉塞或盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。

4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。

6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或

写上字“－” “＋”。

（二）器皿的消毒

干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。160℃、l20分钟，消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。

湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121℃时算起。一般蒸气消毒30分钟。橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。

各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：

培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟

布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟

实验三 培养用液的配置

实验用品

实验器材：

1000ml的量筒2个，1000ml的烧杯2个，磁力搅拌器一台，玻璃棒两个，感量

0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,

化学试剂:

NaCl,KCl, KH2PO4 ,Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O, NaHCO3, 小牛或胎牛

血清,胰蛋白酶,醋酸。

实验要求及方法

（一）PBS液

实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)

1. PBS贮存液配法

NaCl(AR) 8.5g； KCl(AR) 0.2g； KH2PO4 0.27g；Na2HPO4.12H2O 2.85g

(或Na2HPO4.2H2O 1.13g) 溶于100ml双蒸水中。

2. PBS应用液配法

取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或

4℃保存备用。

3．配制BSS液的要求

（l）BSS液中各试剂规格为一级GR试剂（guaranteed reagent）或二级AR（analytic reagent）试剂.

（2）配制后液体呈桃红色，pH 7.4左右没有混浊和沉淀。

（3）含钙镁离子的物质要单独溶解.

（4）可配制10倍浓度的贮存 …… 此处隐藏：11502字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……