醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

山东大学生物化学实验报告

生物化学实验报告

题目：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 姓名： 学号： 班级： 时间：

一、 实验目的：

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。

二、 实验原理：

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带静电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法奖它们分离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白，β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见表1），在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH7.0，所以在缓冲液（pH8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量

蛋白质名称

白蛋白

α1-球蛋白

α2-球蛋白

β-球蛋白

γ-球蛋白

三、 实验器材：

醋酸纤维薄膜（2㎝×8㎝，厚度120μm）、人血清（新鲜、无溶血现象）、培养皿Φ10㎝（×5）、点样器（或玻璃片）、镊子、玻璃棒、电吹风、吸管5.0㎝（×1）、电泳槽、直流稳压电泳仪。

四、 实验试剂：

1. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）：称取巴比妥钠

（A.R.）12.76g和巴比妥（A.R.）1.66g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计校正后使用。

1

等电点（pI） 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.50 相对分子质量 69000 200000 300000 90000~150000 156000~300000

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2. 染色液：氨基黑10B0.5g、甲醇（A.R.）5ml、冰乙酸（A.R.）10ml，加蒸馏水40ml，混匀即可。

3. 漂洗液：95%乙醇（A.R.）45ml，冰乙酸（A.R.）5ml，加蒸馏水50ml，混匀即可。

4. 透明液：无水乙醇：冰乙酸（A.R.）=7:3，混匀即得。

五、 实验步骤：

1. 薄膜浸泡：将醋酸纤维薄膜在缓冲液中浸透（30min），取出后出去多余缓冲液。

2. 调整电泳槽水平，加电极液。

3. 点样：用盖玻片蘸取少许血清，然后将其与距离薄膜一端1.5㎝处接触。血清投入后移去载玻片，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的电桥上，点样端为阴极。

4. 电泳：先平衡10min，后90V预电泳10min，再调电压110V，电泳50min~1h，结束。（点样带不要接触滤纸条）

5. 染色：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中9~10min。

6. 漂洗：取出薄膜，用漂洗液漂至背景无色（约4~5次），再浸于蒸馏水中。

7. 透明：将薄膜平贴于干净的玻璃器皿壁上，用配制好的透明液滴在薄膜上，薄膜逐渐透明，待其完全透明后，用吹风机将薄膜吹干，然后小心将透明条带揭下。

六、 实验结果：

实验得到如下的透明条带，可清晰地看到电泳产生的五条蛋白质带：

七、 结果分析：

1. 将薄膜放置在电桥上时，应注意将点样的一面向下。

2. 取薄膜时应用镊子，不要用手接触。

3. 用吹风机吹干透明液时，要将薄膜平贴，否则薄膜可能会干卷。在揭下薄膜时要确定已经吹干，而且不能用力过猛。

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