感受态细胞和质粒DNA的转化(五)

基因工程

感受态细胞和质粒DNA的转化

陈 溥言 南京农业大学

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重组DNA分子导入受体细胞

导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法

重组DNA导入哺乳动物细胞:

DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法

酵母菌转化法:

完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法

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大肠杆菌(Escherichia coli)

大肠杆菌(Escherichia coli)大约含 3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。 革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度 37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加 甘油，培养皿密封。 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期 (生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、 稳定期(饱和期)，约1×109 ~2×108/mL和衰老期。

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2. 菌株的保存

大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株

在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同 条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株 比大肠杆菌X1776株保存期长。 所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再

做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生

长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。

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具体保存方法：

① LB琼脂平板划线，37℃，倒臵平板培养(16-24hr)，形成

单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔 绝空气)，倒臵放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。

E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中， 4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。 ② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。 ③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入1050%甘油培养基中，分装，臵-20～ -70℃。可经过30次冻融， 细菌仍然存活。

菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速 冻后臵-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。

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菌株保存液的配制

琼脂穿刺培养基

琼脂（Difco） 细菌胰蛋白胨 （Difco） 6g 10g

2×冰冻培养基

K2HPO4 N++-柠檬酸 12.6g 0.19g

NaCl HCl ddH2O

8g 20mg 至1L

MgSO4＞H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油 dH2O

0.18g 1.8g 3.6g 88g 至1L

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高压灭菌

Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helper phage -4℃ 臵于—20℃或—80℃，并一个月检查一次

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抗生素的配制

抗生素

工作浓度 松驰型质粒 60ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL

氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水） 氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan)

34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）

170ug/mL 50ug/mL

25ug/mL 10ug/mL

链霉素(Sm)

四环素(Tc)

10mg/mL（水）

5mg/mL（乙醇）

50ug/mL

50ug/mL

10ug/mL

10ug/mL

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大肠杆菌感受态细胞制备和贮存

在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体

DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细

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