单克隆抗体制备的亲和填料在血浆高丰度蛋白分离中的应用

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中国生物工程杂志　ChinaBiotechnology,2008,28(5):71～77

技术与方法

单克隆抗体制备的亲和填料在血浆高丰度

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蛋白分离中的应用

王云丹　宁云山　彭丹丹　李　妍　方勤美　邓新宇　姜　颖明

(1南方医科大学生物技术学院　广州　510515　2(3)

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摘要　。从已建株的17株抗人血浆ProteinGSepharose4B吸附,然后用交联剂μl(结合DMP()ProteinG蛋白共价交联。实验结果显示600l。填料重复使用10次后吸附能力无显著改1mg抗体变。MALDI2TOF/TOF鉴定主要为白蛋白和球蛋白及其碎片,但发现吸附的蛋白有转铁蛋白,纤维蛋白原,抗胰蛋白酶,前脂蛋白,VitaminD结合蛋白,Keratin10和CD5抗原相似蛋白。实验结果表明该方法能在固定目的抗体的同时最大量地保持抗体活性,该方法有望在蛋白质组学研究的高丰度蛋白分离中得到广泛应用。关键词　单克隆抗体　定向固定　高丰度蛋白　血浆蛋白质组

中图分类号　Q819

　　人类蛋白质组学计划(HUPO)开始以来,血浆蛋白质组逐渐成为研究热点之一

70%左右

[1,2]

[1]

目的蛋白且不需要复杂的色谱设备,所以在血浆蛋白质组研究中得到了广泛应用。染料吸附法虽存在大量非特异吸附,由于价格便宜,目前仍有使用

[10]

。人类血浆蛋白质能提

供丰富的生理特征信息。但白蛋白和球蛋白占总蛋白

,在目前常用的22DE/MALDI2TOF2MS/

[1,2]

。

　　以抗体为配体制备的填料在一些天然蛋白纯化中已得到成熟应用,目前常用共价固定抗体的方法有:以

CNBr活化的Sepharose载体和抗体上的氨基反应共价

MS,LC2MS/MS技术平台下,高丰度蛋白给低丰度蛋白

的分离、鉴定带来极大的困难。分离去除高丰度蛋

白作为解决该困难的主要方向之一。

　　目前分离血浆中这两种高丰度蛋白的方法有:化学沉淀去除法

[3]

固定,但抗原结合区氨基与CNBr基团反应使固定的抗体失去活性,研究发现有效的固定为实际结合量的1/3左右,但实际上不同抗体的抗原结合区氨基活性与Fc段氨基活性不同,在反应中有竞争作用,有效固定的抗体和这两区域的氨基活性比有关

[11～13]

;高丰度蛋白配体吸附法:其中包括染

[4～6]

料、抗体(多克隆抗体,单克隆抗体和禽类IgY)、Protein

G/A和多肽片段吸附等

;低丰度蛋白富集吸附法

如植物凝集素吸附糖蛋白谱法等

[9]

[7,8]

、疏水微球或表面吸附低

[2]

;第二类是抗体

分子量蛋白质,如SELDI2TOF的方法;以及多维色由

Fc段的糖基团为连接位点,氧化末端糖基为醛基,和载

。于抗体吸附的方法能够高特异性地分离

体上氨基反应后共价固定,该方法在实际反应过程中会发生自偶联现象,即抗体分子间的氨基和醛基发生反应形成高聚物使固定的有效抗体难以精确定量,并且某些单克隆抗体的糖基含量低,不适合用此方法固定

[12]

收稿日期:2007212228　　修回日期:2008202205

3国家“863”计划(2006AA02A311)、国家“973”计划(2001CB5102)资助项目

33通讯作者,电子信箱:mingli2006_2006@http://doc.guandang.net

;第三类以抗体的羧基为连接位点的固定方

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中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.52008

法在实际操作过程中也存在自反应现象,且反应条件中pH变化大,对抗体活性有影响

[11～13]

(ABI,USA),Supersignalwesternblot,BCAAssaykit为Pierce公司产品。羊抗鼠IgG2HRP,鼠抗人白蛋白抗体

。第四类

ProteinGSepharose4B吸附抗体,然后用DMP(庚二亚为博士德公司产品,正常EDTA抗凝人血浆由广州市珠江医院心内科惠赠。

1.2　抗人血浆白蛋白单抗的定向固定

氨酸二甲酯二盐酸盐)使之与ProteinG蛋白共价交联,使抗体定向固定ProteinGSepharose微球上,使抗原结合区面向外部。共价反应过程中由于抗体预先吸附在填料上因而不存在抗体间自反应交联,且该方法反应条件温和,不引入带电荷基团,能保证抗体分子的总电荷不变白。

　　以多克隆抗体制备的MARC(MultipleAffinity

RemovalCartridge)和MARS(MultipleAffinitySystem)产品系列,能同时吸附六种血浆高丰度蛋白,[8,9,11～13]

　　50mg纯化的抗体和15mlProteinGSepharose4B

(50%胶)室温反应20min,抽滤去除未结合抗体,加入30ml0.1mol/LPBS,清洗3次。加入偶联缓冲液(30mmol/LDMP100mmol/L,pH8.5,临用时

。我们采用DMP和proteinG的固定方

法,同时用未饱和的ProteinG结合位点吸附分离球蛋配制),室温混合反应30min,DMP。加入止(,pH9.0)反应

30m然0.洗3次。用1mol/L2HClpH2.5清洗,最后用0.1mol/L30mL4℃保存。1.3　血浆白蛋白球蛋白吸附分离实验

异性高,重复次数可达200次,得到广泛的评价和应用[14～18]

μl填料和50μlProteinG　　每管SpinX加入600

μl0.1mol/LPBS清洗三次,加入人sepharose4B,用500

血浆(1∶10稀释,0.1mol/LPBS)室温孵育20min,μl0.1mol/L3000r/min离心1min收集流出液,加入300

PBS,3000g离心1min,重复3次,合并所有流出液为分

。

用单克隆抗体代替多克隆抗体能减少高价值抗原的使用,抗体生产稳定,抗原结合区一致,适合蛋白质组研究的高重复性要求。筛选亲和力适中、与其他血浆蛋白交叉反应低的单克隆抗体可很好的应用于高丰度蛋白的分离去除研究中。我们筛选了17株抗白蛋白单克隆抗体,选用其中一种抗白蛋白单克隆抗体和

ProteinGsepharose4B分离血浆样品中白蛋白和球蛋

μlGly2离高丰度蛋白后样品。加入300HClpH2.5,室温孵育10分钟,3000g离心1min,收集流出液洗脱的结μl0.1MPBS清洗3次进行合蛋白,重复2次。用500

再生。共重复10次吸附去除实验。流出液和洗脱液分别测定蛋白浓度。

1.4　免疫印迹实验

白的方法,为血浆蛋白质组学建立可靠通用的技术平台。同时随唾液、尿液等其他样本作为蛋白质组学的研究对象,样本中的高丰度蛋白如唾液淀粉酶、微球蛋白的分离也需合适的方法,本研究可望能在其中得到广泛应用

[2]

　　SDS2PAGE电泳后按《蛋白质技术手册》进行湿法转膜,转移完成后NC膜于5%脱脂牛奶中封闭过夜,

TBST缓冲液清洗3次,每次10min,后加入1∶1000鼠

。抗人白蛋白抗体,室温孵育1h,TBST缓冲液清洗3次,

1:3000加入二抗羊抗鼠IgG2HRP和羊抗人IgG2HRP,

1　材料与方法

1.1　试剂和仪器

室温孵育30min,TBST缓冲液清洗3次,每次10min。把膜取出后用MilliQ水漂洗后立刻加1.5mlsuper

[19]

　　抗人血浆白蛋白抗体为本实验室筛选,人血浆signalwesternblot反应液,1min后把NC膜取出后用保

白蛋白,CNBractivatedsepharose4B,ProteinGsepharose

4B(美国GEHealthcare公司),DMP(Dimethylpimelinediimidatechloride),DTT(二硫苏糖醇),二乙醇

鲜膜包好放入暗盒进行X光片曝光。最后经显影、定影后保存结果。

1.5　双向电泳(22DE)

胺,三乙醇胺,碘乙酰胺,乙腈,CHAPS购自美国Sigma公司,测序级胰酶购自美国Promega公司,SpinXtube

(Corning,USA),17cmpH3210NLReadystrip,PROTEANIEFCell

TM

　　分离高丰度蛋白后的样品和洗脱的蛋白样品经冷冻干 …… 此处隐藏：13973字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……