结核分枝杆菌重组融合蛋白的制备

结核分枝杆菌重组 融合蛋白的制备及 应用价值研究

目 研究背景 研究目的 研究材料

录

研究方法 研究内容

1、结核分枝杆菌重组融合蛋白rEC的原核表达 2、结核分枝杆菌融合蛋白血清学诊断价值研究 结果与分析

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研究背景

ESAT-6和CFP-10是从短期培养滤液中分离的两种低分子量蛋白，在MTB感染早 期阶段即可被机体识别，具有良好的免疫原性。这两种蛋白均由RD1区编码，为 MTB所特有，而BCG及其它非致病性分枝杆菌缺乏。 结核分枝杆菌PstS1(38KDa)蛋白是目前被证明最有效的单个血清学诊断抗原， 已被用于多个商品化的诊断试剂盒开发，但在敏感性方面仍有其局限性。 结核分枝杆菌HspX(16KDa) 蛋白作为小分子热休克蛋白和主要膜蛋白，不仅 能诱发T细胞介导的免疫应答反应，还具有伴侣蛋白的活性，可以作为很好的协 同抗原。 因而ESAT-6、CFP-10、38kD和16kD是诊断动物和人MTB感染的特异性诊断试 剂,但单独使用存在阳性检出率低问题[9]。 已有研究表明单一抗原用于结核病血清学诊断存在阳性率低的问题[9]。 本研究制备rESAT6-CFP10和38kD-16KD、ESAT6-38kD-16KD融合蛋白，探讨 其在结核病诊断方面的应用价值。

研究目的 克 隆 、 表 达 并 纯 化 结 核 杆 菌 H37Rv 株 重 组 融 合 蛋 白

rESAT6-

CFP10,优化表达纯化条件，大量制备高纯度有免疫反应性的重组 蛋白rEC。 表达并纯化结核杆菌H37Rv株重组融合蛋白

38KDa-16KDa 和

ESAT-6-38KDa-16KDa

,优化表达纯化条件，大量制备

高纯度有免疫反应性的重组蛋白rEC;用ELISA和DIGFA法评价上述3种 纯化蛋白的结核病血清学诊断价值。

材料

实验菌株 1、克隆菌株E.coli TG1购自Pharmacia公司 2、表达菌株E.coli BL21(DE3) pLysE购自Promega公司 3、含目的基因38KDa-16KDa 和ESAT-6-38KDa-16KDa的表达菌株 E.coli BL21(DE3) pLysE系新技术开发室丁建祖老师提供。 载体质粒 1 菌株质粒pET23b购自Novagen公司 2 pMD®19-T Simple Vector和pCR2.1 TA cloning Kit购自Takara公司 基因组 结核杆菌H37Rv株基因组DNA由美国科罗拉多大学John T. Belisle博士 惠赠 实验试剂 1、酶类相关试剂 DNA Marker DL5000, 限制性内切酶NdeI、XhoI, Taq酶均购自Takara公 司。 pfu DNA聚合酶购自Promega公司。 AxyprepTM DNA Gel extraction Kit和AxyprepTM plasmid miniprep kit 购自AXYGEN 公司。 2、其它相关试剂

研究方法

PCR CaCl2法 碱裂解法 SDS-PAGE 电泳 Western blot 超声破碎 亲和层析 透析 低压冷冻干燥 ELISA法 DIGFA法

第一部分 结核分枝杆菌融合蛋 白rEC的原核表达

实验方法

2.1引物设计及合成15 2.2融合基因的扩增15 2.3 TA克隆载体的构建及鉴定16 2.3 .1构建克隆载体pMD®19-T-ec16 2.3 .2 感受态细胞制备16 2.3 .3 转化16 2.3 .4质粒提取与酶切鉴定16 2.3 .5 序列测定17 2.4 重组质粒的构建及鉴定17 2.5 目的基因的诱导表达17 2.6 亲和层析纯化重组蛋白18 2.6.1样品制备18 2.6.2 层析19 2.7 融合蛋白的免疫反应性分析19 2.8 透析和低压冷冻干燥20 2.8.1透析20 2.8.2 BCA法测蛋白浓度21

结果一 融合基因的扩增

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 1、 DL7000 DNA Marker 2、 PCR product of east6 3、 PCR product of cfp10

结果二 TA克隆载体和重组质粒 的构建

图2 PCR扩增产物和重组质粒酶切产物琼脂糖凝 胶电泳结果 1、DL5000 DNA Marker 2、PCR product of east6 3、PCR product of cfp10 4、PCR product of ec fusion gene 5、pMD®19-T-ec digested by NdeI and XhoI

结果三 重组融合蛋白的表达

图3 rEC融合蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果 1. BL21(DE3) pLysE negative control 2. pET-23b(+)-ec in BL21(DE3) pLysE after IPTG induction 3. Total lysates after supersonic 4. Supernatant after supersonic 5. Inclusion body after supersonic 6-7. Purified rEC fusion protein 8. Protein marker

结果四 融合蛋白的含量测定超声碎菌后的上清液经HisTrapTMHP亲 和层析预装柱纯化后的蛋白主要存在于第1ml 洗脱液和第2ml洗脱液中(见图3),第1ml洗脱 液样品SDS-PAGE电泳结果经光密度扫描分 析表明其纯度为97.2%。BCA法测定其浓度 为0.28mg/ml。

结果五 融合蛋白的免疫反应性分析

图4 rEC融合蛋白免疫反应性分析Western blot结果 1.EasyWestern Protein Standard 2. Negative control of purified rEC fusion protein that health serum added as the first antibody 3. purified rEC fusion protein 4. Negative control of lysates after induction that health serum added as the first antibody 5. lysates after induction

小结

成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-ec,并诱导其 各自在大肠杆菌中高效表达21kDa的融合蛋白，主 要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，融合蛋白 rEC表达量约占菌体总蛋白的35%。 通过HisTrapTMHP亲和层析预装柱纯化，获得了高 纯度的融合蛋白，纯度为97.2%。BCA法测定其浓 度为0.28mg/ml。 含重组质粒的诱导菌和纯化后的融合蛋白均与确诊 的肺结核患者血清在21kDa处检测到明显的杂交带， 提示融合蛋白可作为结核病诊断候选抗原。