164色谱法在药品研发中的应用及常见问题分析(2)

内标法用于GC和HPLC减小测定误差，曾经起到很好的作用，特别是在GC中，进样量小，内标法能显著提高定量精度，随着现代分析仪器的发展，原手动进样已被定量环或自动化程度高的进样器所取代，内标法的应用受到挑战，尤其在HPLC中，由于进样量大，外标法已具有很好的进样精度，加入内标，有时反而对分析不利，有研究者曾随机选取药典中八个内标法测定含量的药品进行试验，结果表明，内标法均不能提高分析精度，实际上，内标法使分析误差与经常校准的外标法相比增加了√2倍，说明测定两个峰比测定一个峰引入的误差要大。一般情况下，如下情况适合于使用内标法：复杂的样品制备过程，如多次提取；低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究；在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药代动力学研究。外标法多用于原料验收、成品质控、稳定性和TLC法，内标法多生物体液和GC法。需要注意的是，在外标法中，保持供试品浓度与对照品浓度相近可以改善方法的准确性。 峰高定量仅在峰高随样品量呈线性变化时使用，当峰形不正或色谱柱超载时，峰高法会出现较大误差，由于峰高测量受相邻重叠峰的干扰较小，故比峰面积定量更为准确，如BP中庆大霉素C组份检测明确要求峰高定量。峰面积定量的好处是其精度受仪器参数变化的影响较小，对不是高斯分布的峰形也能较好定量，但其准确度受相邻峰重叠的影响。一般情况下，为得到较好的精确度，宜用峰面积定量；为最大限度地排除其它组份的干扰，则多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。 三、申报资料中几种常见问题

1、方法灵敏度不够－－定量限高于杂质限度

例1.有关物质检查法的定量限为0.75ng，标准规定杂质限度不得过1.0%，折算为0.5ng，表明此法不能有效检测产品杂质，需重新建立有效的杂质检测方法。 2、检测方法缺乏互补性

例2.某药品有关物质研究中显示，合成中重要中间体N－环己基－5－（4－氯丁基）－1，2，3，4－四氮唑在检测波长处无吸收，故建立的有关物质检查方法无法检测该物质。需建立该中间体适宜的检测方法，考察其在产品中的残留情况，视情况订入质量标准。

例3.提供的有关物质检查方法不能检测中间体，请制订合适的中间体检测方法（如TLC法等），并提供方法学研究资料，考察其在产品中的残留情况，视情况订入质量标准。

3、强制降解忽视药物的敏感条件

例4.对乙酰氨基酚水解后极易受到氧化破坏，需补充考察本品氧化破坏后主成分与降解物的分离情况，以验证有关物质检测方法的可行性。

4、强制降解条件过于剧烈，无法判断主峰与降解产物的分离情况

例5.样品经碱解、氧化破坏后，主药头孢特仑匹酯被完全破坏，无法说明其降解物与主峰的分离情况，需调整降解条件的剧烈程度，考察主峰与降解产物的分离情况。 5、供试液制备处理欠妥，不能如实反映产品有关物质情况

例6.某药品有关物质检查中供试液制备经过了碱化、萃取等复杂过程，是否会引起产品中有关物质的变化而影响检出结果，需说明或改进供试液制备方法。

例7.为提高供试液中主药浓度，其制备经过了固相萃取过程，测定结果难以如实反映产品中杂质情况，建议改用其他合适方法。 6、检测波长缺乏针对性

例8.从提供的UV图谱可见，氢溴酸右美沙芬具有很强的末端吸收，220nm附近的吸收强度远高于278nm波长处，需提供同一份加速破坏样品分别用该两波长检测时的色谱图，并比较其杂质峰的个数及峰面积，以确定合适的检测波长。 7、忽视合成中间体、粗品在方法专属性验证中的作用

例9.某药品在合成中，可产生其产品或中间体的顺式异构体等副产物，其结构相似难以分离，需考察在拟定色谱条件下，主成分与各中间体、副产物的分离情况，必要时在系统适应性验证中规定最难分离物质对的分离度要求，以确保色谱系统的有效性。 8、积分时间不充分，不能有效检出有关物质

例10.氧化破坏试验中，主峰保留时间的3倍处，仍有降解物峰出现，而标准规定色谱图记录至主成分峰保留时间的2倍，不能有效检出有关物质，需改进，并用改进后的方法重新进行影响因素试验及长期稳定性研究的后续试验。

例11.某药品有关物质检查色谱图记录时间为30分钟，但仅选择“基线平坦、无任何杂质峰”的3－15分钟内积分，应在全记录时间段内积分以有效检出有关物质，并以此重新进行稳定性研究。

9、方法学研究结论未充分反映到质量标准中

例12.溶液稳定性试验表明供试液仅在1小时内稳定，需在质量标准有关物质和含量测定项下注明“供试液及对照品溶液应配制后立即进样”，以保证测定结果的准确可靠。 例13.某药品在拟定色谱条件下，主峰与杂质Ⅱ的分离度仅为1.3，需在质量标准有关物质检查的“色谱条件与系统适应性试验”中规定该物质对的分离度要求，以确保有关物质有效检出。

10、方法学研究不全面

例14.某药品有关物质检查的流动相水－磷酸（100：0.1）中缺少有机改性剂，且与对照品保留时间的一致性也作为本品鉴别依据，需提供同一供试液重复5次进样的峰面积和保留时间的RSD值，以验证色谱系统的稳定性。 11、限度确定明显欠妥，或依据不充分

例15.某输液剂有关物质限度为不得过1.0%（HPLC法）,但中国药典2005年版二部收载的本品原料及其片剂的有关物质限度（TLC－自身对照法）为不得过0.25%，需照此修订有关物质限度，制订单个杂质限度为不得过0.25%，以确保产品质量。 例16.本品（粉针剂）有关物质限度较宽（20.0%），其依据尚显不足，需用相同方法检测原发厂市售效期内同品种注射液有关物质含量，作为本品有关物质限度制订的依据之一。 备注