石蜡切片的制作过程

植物显微技术过程中石蜡切片的制作过程

石蜡切片的制作过程

（一）花药切片制片法 1．取材

2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。

4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d

5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。 6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。

7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。 10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

植物显微技术过程中石蜡切片的制作过程

制片日程

（二）花芽纵切片制片法 1．取材

2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。

4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。

5．脱水及复染：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇，每级3~4h。含0.5%~1%伊红的95％乙醇中4~6h（可以过夜），无水乙醇2次，每次2h。

6．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级2~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1d。

7．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。 8．修蜡块、切片：纵切花芽，切片厚8μm。

9．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

植物显微技术过程中石蜡切片的制作过程

10．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。 制片日程

（三）子房纵切片制片法 1．取材

2．固定：纳瓦申固定液中固定24h。

3．保存：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，每级30min，并保存于70%乙醇中备用。 4．脱水：经85%乙醇，含0.5%~1%伊红的95％乙醇中3~4h，无水乙醇2次，每次2h。 5．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温

植物显微技术过程中石蜡切片的制作过程

箱中1~2d

6．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋时子房横卧，使扁平面与纸盒底部平贴。

7．修蜡块、切片：沿子房扁平面纵切，切片厚12μm。镜检，只保留切到胚囊的蜡片，其余淘汰。

8．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

9．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

10．复水：1/2无水乙醇+1/2二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水。

11．媒染：4%铁矾10min。铁矾即绿矾，硫酸亚铁。 12．水洗：自来水流水洗10min。 13．染色：0.5%苏木精10min。 14．水洗：自来水流水洗5min。

15．分色：2%铁矾分色至适度（镜检确定）。 16．水洗、反蓝：自来水流水洗10~15min至反蓝。

17．脱水、透明：滴注蒸馏水、各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、），含1%伊红的95％乙醇中复染，再经无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯滴注后，置二甲苯缸中。

18．封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

超薄切片法

（一）以Epon 812为包埋介质的植物组织制样流程 1 取材：常温取样，低温保存（0~4℃）。

2 固定和浸洗：1%~3%戊二醛固定液固定2h，最多不超过1周。PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)，然后1%~2%OsO4固定液固定1~2h，PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)。 3 脱水：30%丙酮水溶液，50%丙酮水溶液，70%丙酮水溶液（或冰箱过夜）10~20min，在常温条件下，90%丙酮水溶液，100%丙酮水溶液，“纯丙酮”（更换2次）每次10~20min。

植物显微技术过程中石蜡切片的制作过程

4 渗透：Epon 812混合液：纯丙酮（1:3）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（1:1）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（3:1）12h，Epon 812混合液（35~40℃）12h。

5 包埋和聚合：将组织放入胶囊（或包埋板）中，加入新鲜的Epon 812混合液，放烘箱中加热35℃12h ，45℃12h ，60℃24h ，树脂聚合后，待冷却到室温，进行切片。 6 制刀：用制刀机制出刀刃锋利的玻璃刀。若用钻石刀则省略此步。 7 修块：经粗修，将包埋块修整合适。

8 切片：在切片机上固定好包埋块和切片刀，调整刀位后对刀、进刀，完成细修后切片，厚度60~80μm，铜网捞片，风干或灯下烤干。

9 染色：常规铅-铀染色。（把一张滤纸平铺在有盖平皿底部。用配制染剂的溶液将其润湿，上放一小片干净牙科蜡。将染液滴于蜡块上，迅速盖上平皿盖。将欲染载网浮在液滴上，注意切片朝下。一般采用铀-铅双染法：先用1～3％醋酸双氧铀水溶液或70％酒精溶液将载网按上述方法染20～30min。染后必须清洗，一般用钟表镊子夹载网浸入清洗液中，反复清洗，清洗液可放在试管中或小瓶中。经三瓶清洗液即可。注意将镊子中间夹缝液体用一小片滤纸将其吸干。用硝酸铅与柠檬酸钠配制成柠檬酸铅，将其溶于氢氧化钠，可得到稳定的强碱溶液（pH12）。染、洗方法同前。用铅染时，可用0.1MNaOH浸湿滤纸，以吸收空气中CO2，防止生成碳酸铅沉淀污染切片。或将NaOH放在牙科蜡周围。配制染液用的蒸馏水应煮沸10min以驱除CO2，染毕，用0.02NNaOH(准确称取取0.8g的氢氧化钠，溶于500ml蒸馏水中，再移入到1000ml容量瓶中，定容至刻度。)和无CO2蒸馏水连续冲洗以除去载网上多余染液，载网清洗后置于培养皿的滤纸上干燥。）

10 镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥后，在透射电镜下观察实验结果。 （二）整体样品表面结构观察的制样方法

1 取材：取样要准确，体积不宜过大，以减少不必要的观察量。取样时动作要轻巧，防止挤压损伤样品。

2 固定：一般采用双固定法，即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下固定。一般单细胞可固定10~30min，较大的样品固定1~2h，甚至更长，再用1%OsO4/缓冲液在4℃下固定30~60min。

3 清洗：对于表面凹凸不平，且粘有很多杂质的样品，在固定前后都要进行彻底的清洗，以免影响 …… 此处隐藏：4428字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……