微生物原生质体融合技术研究进展

微生物原生质体融合技术研究进展

维普资讯 http://www.77cn.com.cn

动物医学进展，0 8 2 ( ) 6—7 2 0,9 5:46Pr g e si e e i r e cne o r s n V t rna y M dii

微生物原生质体融合技术研究进展王春平 L, 2韦强鲍国连，,刘燕邵泽香，,季权安( .江省农业科学院畜牧兽医研究所，江杭州 3 0 2; . 1浙浙 1 0 1 2山东农业大学动物科技学院，山东泰安 2 11 ) 7 0 8

摘

要：原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、物学、疫学、医学以及医药、品、生免兽食农

业等方面都有广泛的应用价值，文章就原生质体制备、生及其融合过程中的影响因素做了综述，外还对再另原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较，为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。关键词：原生质体融合；影响因素；合方法；融筛选方法中图分类号： 8 3 2 Q 1 .文献标识码： A文章编号：0 75 3 (0 8 0-0 40 1 0-0 8 20 )50 6—4

原生质体融合也称细胞杂交、胞融合或体细为 5: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用细 3:胞杂交，是指细胞通过介导和培养，离体条件下用在

微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使

人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个用一种酶的效果好，一定范围内，在酶作用的时间和核或多核的杂合细胞的过程[。原生质体融合技术酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关， 1]而 E A可 起源于 2世纪 6 O O年代。1 6 9 0年法国的 Kas i rk研与再生率成反相关。另外， DT作为螯合剂，以究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果， 了自发融合现象。 1 7 9 4年匈牙利的 F rn z 从而提高原生质体的形成率。据报道，大肠埃希 ee cy L对等采用离心力诱导的方法，道了白地霉营养缺菌来说， E A洗涤后，以除去对酶解不利的报用 DT可陷型突变株的原生质体融合，而使原生质体融合金属离子[。另一方面，从 7 3在原生质体制备前，

用适量

技术成为微生物育种的一项新技术，从微生物种的青霉素对菌体进行预处理，以抑制肽聚糖合成并可内融合扩展到界间的融合。路玲玲等采用融合技过程中的转肽作用，利于原生质体的形成。根据有

术成功构建耐高温高产酒精酵母，至此，生质体融酶反应动力学原理，解温度直接影响酶促反应的原酶合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质

速度，如放线菌的最适酶解温度为 2 8℃~3 7℃,真菌的最适酶解温度为 3℃~3 o 5℃[。在高渗 T i a] r s溶液中添加 1 /聚乙烯吡咯烷酮 ( VP等原 5 mL L P )生质体扩张剂，有利于溶液中细菌的分散，有助于制质体的稳定。关于原生质体的再生，孔兴等聃报吴

体融合技术已在农业、医药、保等领域取得了开创环性的研究成果，而且应用领域不断扩大[。 4]1原生质体融合技术

微生物原生质体融合技术的整个过程包括：原备原生质体，加 0 0 lL镁离子，添 . 2mo/有利于原生生质体的制备，生质体融合，生质体再生[。原原 5 3 1 1原生质体制备与再生过程中的影响因素 .

道在原生质体高渗再生培养基中加入 03mo/的 . lL

制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，在去蔗糖和 0 2 mo/的丁二酸钠是合适的，玉华现 . lL王除细胞壁的主要方法是使用酶法，用的酶主要为等[]道在高渗再生培养基中加入 0 5mo/的使 1报 0 . lL蜗牛酶或溶菌酶，体根据所用微生物的种类而定。具

蔗糖是适宜的，可能要根据不同的微生物种类而这影响原生质体制备的因素很多，同的微生物有其定。不 较为适当的形成条件。在菌龄选择上，采用对数 1 2原生质体融合过程中的影响因素多 .生长中后期的细菌，主要是由于对数生长期细菌这 1 7,牙利的 F rn z道了离心力诱导 9 4年匈 ee cy报的细胞壁中肽聚糖含量最低，胞壁对酶的作用最法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随细

敏感。王燕 L对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备后人们相继用 Na 1KC和 C (。。 6] C、 1 a NO

)等作为诱变的过程中，用纤维素酶、壁酶、牛酶混合浓度比溶蜗剂进行融合，融合频率都很低。聚乙二醇在适量但

收稿日期：0 80—3 2 0—20 基金项目：江省重点科技攻关项目(0 5 10 1 2 0 E 0 1 )浙 2 0 C 2 2,0 5 60 4

作者简介：王眷平( 9 2,山东淄博人，士研究生， 18一)男，硕主要从事动物传染病研究。 *通讯作者

微生物原生质体融合技术研究进展

维普资讯 http://www.77cn.com.cn

王春平等：生物原生质体融合技术研究进展微

6 5

C抖存在下能有效地诱导植物原生质体融合， a a C抖主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的

起，再用高峰值功率密度激光对接触处进行照射，使质膜被击穿或产生微米级的微孔。由于质膜上产生

质稳定性与活性。原生质体膜外在蛋白上二价阳离子微孔是可逆过程，膜在恢复过程中细胞连接小孔处细的存在使膜脂流动性减慢、定性增强，稳这种维持稳的表面曲率很高，于高张力状态，胞逐渐由哑铃

说定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例形变为圆球状时，明细胞已融合了。该技术最突关系， E种类对原生质体融合的影响不大。此 PG

出的优点在于它的高度选择性，用激光微束技术利可诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。但由 于其所需设备昂贵复杂，作技术难度大，操很难推广

外，融合率还受其他诸因素的影响。影响原生质其体融合的因素很多，特别是环境中的阳离子存在，融

虽合时的 p也对原生质体融合有较明显的影响。一应用。此后，有研究者试图以类似原理及较简便 H在微生物原生质体融合中应用激光微束技般来讲 C抖、抖有助于融合。如有 0 0 lL a Mg . 1mo/ 的步骤，",且 C计存在时， a可得到较高的融合率，但在缺乏钙离子术]但融合效率较低，丧失了高度选择性的优还有待进时， p较低，若 H融合频率也较高。这是因为钙离子点。激光诱导融合技术仍处在发展初期，和带负电荷的 P G与细胞膜表面分子相互作用， E使原生质体带电，此易于附着发生凝集所致[ 彼 1。2原生质体融合的

方法 2 1 P G结合高 C抖诱导法 . E a一

步完善。

2 4基于微流控芯片的细胞融合技术 .

随着微机电系统 ( MS技术和微加工技术的 ME )发展，电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，微加之

聚乙二醇 ( E是一种多聚化合物，同种类 P G)不微生物对 P G分子质量的要求不尽相同。放线菌 E 0 4k~ 6k,菌一般采用 4 k~ 6k,菌用 . u u真 u u细 1 5k~ 6 k。亲本原生质体制备好后， . u u即可进行

微通道网络可以整合到生物芯片之上，将使得微这流控系统成为细胞融合的理想平台，用微流控系利 b r等n egA已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合，用基于芯片技术的微流控系统利不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，可以也同时输送、并、离和分选大量细胞，胞融合在合分细芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外，由于在微通道内的腔体容积很小，以会大幅减所少细胞融合中所需的细胞数量，时细胞融合率和同杂合细胞的成活率会大大提高。2 5高通量细胞融合芯片 .

适用分子质量常为 1k u~ 1 5 k,有人使用统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。S rm— . u也 tu

融合。关于促融机制，一般认为 P G本身是一种特 E殊的脱水剂，以分子桥形式在相邻原生质体膜问它 …… 此处隐藏：9513字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……