中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测

枣树

ResearchPaper

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica49(11):1510-1519;4November2009ISSN0001-6209;CN11-1995 Qhttp: http://www.77cn.com.cn actamicrocn

研究报告

中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析

徐启聪,田国忠

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,王振亮,孔繁华,李永,王合

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1(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,国家林业局森林保护学重点实验室,北京　100091)2(河北林业科学院森林保护研究所,石家庄　050061)3(山东泰安市农业科学研究院,泰安　271000)

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(北京市林业保护站,北京　100029)

摘要:【目的】检测不同地区枣树品种上的枣疯植原体侵染及保守基因序列的变异。【方法】利用植原体16SrDNA的通用引物R16mF2/R16mR1、16S-23S间区序列(SR)的通用引物SR1 SR及secY基因引物FD9f r,通过PCR检测采自国内7个地区14个枣树品种上的32个枣疯病和4个酸枣丛枝病样品。将PCR产物进行直接或克隆测序,结合已报导的测序数据,进行序列同源性和系统进化分析。【结果】所有枣疯病样品中均检测到植原体;皆属于榆树黄化16SrV-B亚组,与我国重阳木丛枝和樱桃致死黄化遗传关系更近,而与国外的其他植原体亲缘关系较远。不同地区和不同抗性品种上的植原体在16SrDNA、SR和secY基因上都存在程度不同的序列差异。直接测序法检出的优势株系分布范围很广。不同株系间的secY基因变异比16SrDNA和SR更明显,某些碱基替换并不影响编码氨基酸种类,但有的株系的碱基缺失使编码框中断。【结论】不同地区不同品种枣树上枣疯植原体间存在着较为丰富的遗传多样性,与PCR产物直接测序法相比,用克隆测序结果能检测到更多的碱基突变,对于鉴别不同植原体株系及研究其系统发育关系更为有用。关键词:枣疯病;植原体;16SrDNA;16S-23S间区;secY基因;分子变异中图分类号:X172　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2009)11-1510-10　　枣疯病是我国枣树(ZizyphusjujubaMill.)上的毁灭性病害,几乎遍布我国所有的枣树栽培区,呈现典型的黄化丛枝型病症,病原是枣疯植原体(Ca.Phytoplasmaziziphi)。通过分子生物学研究,已确定其属植原体属榆树黄化组16SrV组B亚组(16SrV-B),并且采用PCR对部分地区的枣疯病样

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品进行了分子检测。但迄今针对我国不同地区、侵染不同抗性枣树品种的植原体则缺乏系统的鉴定和全面的了解,不同分离物间是否存在遗传变异及

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与其他种类植原体的混合感染都不明确,这将影响抗病品种的合理利用、有效的检疫措施的制定和综

合管理水平的提高。

16SrDNA已成为植原体分子检测和分类鉴定的主要依据。Lee等

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根据植原体16SrRNA基因的

RFLP分析,将植原体34个典型的株系划分为l4个组及41个亚组。国际比较菌原体学研究计划(IRPCM)参考16SrDNA序列,将植原体划分为l7个组,24个候选种,至少40个亚组,并制订了相应的

基金项目:科技部“十一五”林业科技支撑计划项目“商品林重大生物灾害防控技术研究”项目(2006BAD08A113-2);国家质量监督检验检疫总局公益性行业科研专项“重要果树黄化病原鉴定技术标准研制”(200810517-3)

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通信作者。Tel:+86-10-62889525;Fax:+86-10-62884972;E-mail:tiangz@http://www.77cn.com.cn

作者简介:徐启聪(1982-),男,山东临沂人,硕士研究生,研究方向为分子病理。E-mail:qicongx@http://www.77cn.com.cn-0426;-06-01

枣树

徐启聪等:中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析. 微生物学报(2009)49(11)1511

分类标准

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。Wei等根据目前已经发表的植原体

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31号先采用引物P1 P7进行第一次PCR,再用SR1 SR2进行巢式PCR,secY引物采用Darire等

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16SrDNA,将植原体分为28个组。使用

16S-23SrDNA间区序列(16S-23SrDNAspaceregion,SR)由于不加入成熟核糖体,在进化过程中承受的自然选择压力非常小,比16SrDNA能容忍更多的变异,其丰富的变异可在较低的分类阶元上解决原核生物系统发育问题,为类群内部的系统重建提供较好的支持

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的引物对FD9f r。

PCR反应体系:50μL体系中含有5μL10×PCRbuffer,上下游引物各0.2mmol L,dNTPs0.2mmol L,TaqDNA聚合酶2U,DNA模板40ng。PCR反应条件:94℃30s,52℃(16SrDNA) 56℃(SR) 51℃(secY)30s,72℃,1min,35个循环;72℃延伸10min,SR的巢式PCR的反应条件同直接PCR。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测(SYBRgreen染色),紫外透射仪下观察,Vilber凝胶成像仪中照相。1.4　PCR产物的序列测定与分析

16SrDNA、SR和secY基因的扩增产物经纯化试剂盒纯化或克隆后,送上海生工生物技术有限公司测序。部分样品的PCR产物经纯化后,直接作为模板进行测序,部分样品的PCR产物连接到质粒载体pMD18T中,克隆到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆进行测序。所得序列用DNAstar、DNAMAN6.0及MEGA3.1软件进行拼接、比对和分子进化遗传分析。

。

跨膜蛋白质secY是原核生物的分泌蛋白转运系统最主要的组成部分,secY基因同16SrRNA基因

一样具有保守性,但核苷酸序列变异较16SrDNA相对较大,基于secY基因序列表现出来的植原体多样性比基于16SrDNA序列的多样性要丰富,更适合

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比较亲缘关系近的植原体亚组及株系。Lee等曾将secY基因用于榆树黄化组(16SrV)的系统分类。本研究采集了全国7个枣产区的14个枣树品种上的31个枣疯病和5个酸枣丛枝病样品,利用16SrDNA、SR和secY引物检测其中的植原体,对PCR产物进行测序,鉴定植原体的种类,比较其序列同源关系,以期了解不同地区不同植原体样品之间分子变异和遗传多样性,为植原体群体分子系统发育与进化、病原致病机制、病害流行预测、抗病品种利用及综合防治提供依据。

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2　结果和分析

2.1　不同地区采集样品PCR检测

所有样品均分别扩增出约1400bp的16SrDNA特异性产物,29个样品通过直接PCR,7个样品(均在11月下旬采集)通过巢式PCR扩增出约400bp的SR特异性引物,而健康枣树和双蒸水对照未扩增出(图1、图2)产物,表明所有枣疯样品中均有植原体的存在。15种样品扩增出了约1400bp的secY基因特异性产物(图3),这部分样品都是在7月到10月之间采集的,而11月份采集的样品均未扩增出secY的特异性产物,可能是患病枣树在这段时期体内植原体的含量有所下降以及PCR反应的抑制物质含量增多造成的。2.2　16SrDNA的序列分析

测得26个菌株的28条16SrDNA序列(表1中序号为:1、2、3、4、9、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、29、30、31、32、33、34、35、36)。26个菌株均进行过1次PCR产物直接测序,吉安大枣和北京龙爪枣植原体除PCR产物直接测序外,还各进行过1次克隆测序,2006年已测定5个林科院枣疯、3

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　供试样品:2006年采集了河南濮阳枣疯(JWBPY),濮阳酸枣丛枝(WJWBPY),北京林科院枣疯(JWBCAF)及香山酸枣丛枝(WJWBXS)。2007年～2008年6月份至11月份,采集了发病严重的枣树嫩枝叶,表1所示。

1.1.2　主要试剂和仪器:质粒pMD18-Tsimplevector购自Takara公司,DNA提取试剂盒、DL2000、PCR反应体系、E.coliDH5α购自北京天根生化科技有限公司。Sigma3-18K台式高速冷冻离心机,EpendorfMastereyelerGradientPCR仪。

1.2　植物总DNA提取

用DNA提取试剂盒(北京天根生 …… 此处隐藏：21099字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……