柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成_杨兴斌

第33卷

分析化学(FENXIHUAXUE)　研究简报第9期

2005年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1287～1290

柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成

杨兴斌　赵　燕　周四元　刘　莉　王海芳　梅其炳

(第四军医大学药理学教研室1,化学教研室2,西安710032)

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摘　要　采用12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化反相高效液相色谱(HPLC)法,建立了9种常见单糖的分离模式,并成功地用于当归多糖的单糖组成分析,具有良好的重复性。结果表明,当归多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成,其摩尔比为0.57∶1.00∶0.13∶

3106∶8.16∶7.17∶12.69。该HPLC方法是简单、快速、灵敏、方便的分析技术,可用于当归多糖的质量控制。

关键词　当归多糖,单糖组成,衍生化,高效液相色谱

1　引　　言

当归多糖是当归的主要水溶性成分[1,2、促进造血、抗

氧化损伤等显著生物活性。环节。因单糖存在互变异构体、、,如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等,。,必须具有高效的分离技术,12苯基232甲2唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC测定单糖含量的方法经过了不断地发展和完善

[3～7]

,并成功地用于毛细管电泳分析。PMP是还原性糖的最好衍生化试剂之一,如PMP衍生物不易

裂解,分析时不产生异构峰,且在250nm处有强烈的紫外吸收。本研究采用PMP衍生化方法,用常规的紫外检测器和C18烷基键合柱,建立适于当归多糖单糖组成测定的HPLC新方法,达到灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的目标。

2　实验部分

2.1　仪器和试剂

Agilent1100液相色谱仪(美国惠普公司);ZORBAXEXTEND2C18分析柱(美国Agilent公司);旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司);EZ2DRY冷冻干燥机(美国Filter公司)。

三氟乙酸(TFA,Merck公司);甲醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂);乙腈(TEDIA公司);PMP(北京化学试剂厂);葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)均购自Sigma公司。其它试剂均为分析纯。当归多糖由本药理学教研室制备2.2　当归多糖水解

[8]

。

精确称取当归多糖样品20.0mg于安瓿中,分别加入2mol/LTFA、2mol/LH2SO4以及其混酸溶液2.0mL,充氮气封管,110℃油浴分别水解2、4、6、8和10h。冷却至室温,反应混合物1000r/min离心5min,取上清液用0.3mol/LNaOH溶液中和到约pH7.0,溶液用于PMP衍生化。2.3　单糖衍生物的制备

PMP在使用前用色谱纯甲醇重结晶两次。衍生化方法参考文献[3～7],并作适当的改进:取配制

好的2mmol/L单糖标准品(9种)各50μL或当归多糖水解液样品各100μL,并分别加入一定量的Fuc内标,置于不同的试管中;依次加入50μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液和0.3mol/LNaOH溶液,混匀;70℃水浴反应30min,取出,冷却10min,用50μL0.3mol/LHCl中和;加入1mL氯仿萃取,充分震荡、

　2004208214收稿;2005202212接受

本文系陕西省科技攻关项目(No2002K102G2)和西安市科技攻关项目(NoSF200224)

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分析化学第33卷

离心,用细针头吸弃下层,重复3次。上层为水相,加100μL水稀释,混匀,20μL进样。2.4　HPLC分析方法

采用Agilent1100色谱系统。检测波长为250nm。柱温为室温;流速1.0mL/min;流动相:溶剂A,15%(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH2PO42NaOH,pH6.9)。溶剂B,40%(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH2PO42NaOH,pH6.9);梯度模式:时间梯度为:0→10→30min,相应浓度梯度为0→8%→20%溶剂B;进样体积20μL。2.5　分析原理与方法

2.5.1　定量校正因子　以Fuc为内标,测定8种单糖的定量较正因子(fi/s)。精密称取各标准单糖并

配制成2mmol/L的母液,用时稀释为5个不同浓度的单糖溶液,制备PMP衍生物,并进行HPLC分析(线性范围在1～10nmol之间)。2.5.2　相关系数与回归方程　以单糖的浓度X(Wi/Ws)与峰面积Y(Ai/As)作图,得回归方程与相关系数。求出各单糖的斜率b,即定量较正因子f。fi/s=(Wi/Ws)/(Ai/As),AS,Ai分别为Fuc内标和标准单糖的HPLC峰面积。

2.5.3　摩尔比的计算　以Fuc为内标,f/M(M为单糖的分子量),所得的值之比为摩尔比,即:Ri/s=fi/s(Ai/3　结果与讨论

3.1　P分离

,本实验对当归多糖可能包含的Glc、Ara、Man、Gal、Rha、Xyl、GlcUA、GalUAFuc等9种标准单糖PMP衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表明,磷酸缓冲液(KH2PO42NaOH)的pH6.9,时间梯度为0→10→30min和相应浓度梯度为0→8%→20%溶剂B的梯度洗脱模式是分离此9种单糖衍生物的较理想色谱分离条件。

色谱峰的各峰保留时间依次为PMP、Man、Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc、异亚丙基丙酮(Mesityloxide)杂质峰[7],如图4(a)所示。其中,内标Fuc与其它单糖有很好的分离,其作为内标是合适的。PMP衍生化试剂不干扰单糖衍生物的分析,因为其出峰时间最快;而Mesityloxide杂质峰也不影

[7]

响分析结果,因为其出峰很慢,远远滞后于各单糖衍生物的紫外吸收峰。3.2　多糖水解样品制备条件优化

多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程,方可进行下一步的衍生化。本样品制备方法省略干燥过程,而将多糖水解液直接用NaOH中和(约中性),中和溶液直接可进行PMP衍生化,这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是:(1)简化工艺、避免干燥损失。(2)该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图1是当归多糖经TFA水解后,

水解液

图1　当归多糖水解样品经干燥过程(a)和无干燥过程(b)对单糖组成测定结果的影响

Fig.1　ThechromatogramofAngelicapolysaccharidehydrolysateswithdrying(a)andwithoutdryingprocess(b)

经传统的干燥过程和未经干燥过程的PMP柱前衍生化HPLC图,图中未发现有明显吸收峰改变。(3)对多糖的含量、组成等定量分析更有意义,因此过程几乎无糖损失,多糖水解液可直接进行PMP衍生

化,可在线大批量分析监测。

第9期杨兴斌等:柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成

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3.3　多糖水解样品PMP衍生化工艺优化

已报道的单糖PMP衍生化方法是将衍生化后的溶液用氯仿萃取,萃取后的水层溶液进行干燥,其

目的是挥弃PMP残留衍生化试剂,纯化单糖衍生物样品。我们的实验结果表明,在本色谱分离条件下,PMP溶剂峰出峰时间明显超前于单糖衍生物峰,所以单糖PMP衍生物的干燥过程对分析结果无影响(图2),故本实验省去此干燥过程,缩短了样品制备时间,便于批量在线分析

。

图2　单糖对照品PMP衍生物的干燥过程(a)和无干燥过程(b)对分析结果的影响

Fig.2　Thechromatogramof12phenyl232methyl252pyrazolon(PMP)ofwithdryingprocess(a)andwitoutdryingprocess(b

)

3.4　当归多糖样品的单糖组成分析

3.4.1　　3所示。当,而在110℃用2mmol/LTFA8h后,水解已完全。可见,当归多糖经TFA水解8h为其合适的水解时间。

3.4.2　不同酸水解对当归多糖的单糖组成测定的影响　选择用

于水解多糖的合适种类的酸对准确测定单糖组成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2SO4及其混酸等不同酸水解方法对当归多糖的组成测定结果的影响(图4)。结果表明,TFA和 …… 此处隐藏：5829字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……