分子生物学实验复习

试验一：植物DNA的提取

1.一个较为合理的DNA提取的标准：DNA纯度能够满足后续的实验标准；所得的DNA构象应该完整；DNA的量应该满足后续实验的要求；操作简单高效，少用毒害大的试剂。

2.SDS法：十二烷基硫酸钠，阴离子去污剂，溶解蛋白，解聚合蛋白，使其与核算分离，一直DNase的作用。

3.CTAB法：十六烷基三甲基溴化铵，阳离子去污剂能和蛋白质和高聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。

4.少至1-10ng的条带都能在紫外灯下检出。

5.DNA电泳迁徙速率的对数与凝胶浓度呈线性关系。

6.缓冲液的组成都含有Tris和EDTA,TAE为冰乙酸，TBE为硼酸，TPE为磷酸。

7.最常用的变性单链DNA的电泳缓冲液是碱性缓冲液。

实验二：DNA酶切与检测

1.DNA检测的方法：分光光度法；限制性酶切法；凝胶电泳法。

2.纯净的双链DNA的OD260/280=1.8，若大于1.8则可能RNA的污染，若小于1.8则可能为蛋白质的污染；纯净的RNA的OD260/280=2.0；OD260/230反应去盐的程度，大于2说明充分，小于2说明不充分，可再次沉淀和用70%的酒精洗涤。1个OD260相当于50微克/毫升的DNA，或40微克/毫升的RNA。

3.限制性核酸内切酶：一类能够识别双链DNA分子中某一特定序列的核酸（通常为4-6个核苷酸长度的回文结构）如AAGCTT（Hind Ⅲ）、GAATTC（EcoRⅠ）、GAGCTC（SacⅠ），并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。主要从原核生物中分离出来；是原核生物的一种自我保护的机制；他们的发现为基因工程奠定基础，现已广泛使用。

4.限制性核酸内切酶在基因工程中的作用：用于构建载体；修饰外源基因检测DNA质量；用于RFLP和southern分析；用于质粒插入片段的分离检测。

5.无法被限制性内切酶切割的DNA提取物，可能是因为杂志过多。

6.电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。

7.影响DNA在琼脂糖中迁徙的因素：DNA分子的大小；DNA的构象（闭合环状>线性>开环）；琼脂糖的浓度。

8.同尾酶：切割不同的DNA片段，但是产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶，他们来源各异，是别的靶标序列也不同，但是产生的粘性末端相同。

9.同裂酶：来源于不同物种，但能够识别相同DNA序列的限制性核酸内切酶，切割位点可以相同也可以不同。

实验三：质粒的提取

1.质粒提取的主要步骤：细菌裂解，质粒DNA的纯化，浓缩。

2.质粒的基本特性：双链的闭合环状的DNA；独立于染色体之外的，但是复制依赖于宿主编码的酶和蛋白质；可以产生抗性之类的表现形。

3.裂解的主要方法：非离子型或离子型去污剂；有机溶剂；碱处理，具体选取哪种方法取决于：质粒的大小，大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化DNA的技术。

4.质粒纯化的方法都利用质粒的特性：DNA相对较小；共价闭合环状。

5.大量质粒纯化的方法：离子交换层析；凝胶过滤层析；聚乙二醇分级沉淀。

6.主要步骤：收集菌体，破碎细胞，质粒与其他物质分离，智力的纯化。

7.人工质粒必须具备的条件：在细胞能能自主复制；有适宜的限制性核酸酶切位点；具备对重组易于检测的选择性标记；携带外源DNA的幅度较宽，具备可促进外源DNA 表达的调

控区；具有很小的相对分子质量和很高的拷贝数；适用于组织化学方法检测重组体；属于松弛复制型。

8.蓝白斑筛选：含有LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能够分解生成X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。而当外源DNA插入后，Lacz基因不能表达，菌株呈白色，以此筛选重组细菌，称之为蓝白斑筛选。

α-互补：质粒上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。

9.质粒载体在分子实验中的应用：外源DNA的克隆表达；基因文库的构建。

实验四：质粒DNA的酶切及PCR分析

1.PCR：聚合酶链式反应，用于扩增位于两段一直序列之间的DNA片段。反复进行变性，退火和延伸的过程。

2.PCR的原料：模板，引物，Taq DNA酶，dNTP，缓冲液，ddH2O

3.在正常情况下，扩增25-30个循环（扩增倍数达到106）Taq聚合酶的量便会成为制约反应的因素，如需继续扩增，可将产物DNA稀释1000-10000倍后作为新的模板继续新的PCR。

4.哪些物质可以作为PCR的模板：基因组DNA；质粒DNA

5.PCR技术的应用：鉴定基因；传染病的诊断；法医学上的运用（亲子鉴定）；引入基因突变点；癌症基因的检测；DNA测序；基因克隆；环境中致病菌和指示菌检测。

实验五：大肠杆菌感受态制备与质粒转化

1.质粒的转移：在自然条件下，质粒可以通过细菌结合的作用转移到新的宿主内。

2.氨苄青霉素筛选：质粒携带的氨苄青霉素抗性基因（ampr）编码一个酶，该酶可以分泌进入细菌外周质腔中，并在腔内催化β-内酰胺环水解，从而接触氨苄青霉素的毒性。

3.转化：使受体细胞从周围介质中吸收外来的DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程。

4.感受态细胞：用于转化的细菌，指细菌细胞处于一种最容易吸收外来物质的DNA状态，一般出现在对数生长期。

5.转化方法：点击法；热击法（热击之前细菌要用Ca2+进行处理）。

6.转化的影响因素：细胞的生长状态和密度；质粒DNA的质量和浓度；试剂的质量；防止杂菌和杂DNA污染；整个操作均需在冰上进行。

实验六：总RNA的提取及分析

1.植物组织总RNA：tRNA; mRNA; rRNA.

2.RNA的用处：Northern杂交分析，基因体外翻译，cDNA文库构建，cDNA末端快速扩增，差异显示反转录PCR。

3.分离总RNA的方法：苯酚法；盐酸胍法；氯化锂沉淀法。

4.最常用的提取试剂：TRIZOL(主要成分为异硫氰酸胍，是一种强变性剂)

5.RNA的260nm与280nm吸收的比值咋2.0以上，当样品蛋白质含量较高时会下降。

6.RNA浓度（微克/毫升）=（A260 * 稀释倍数）/（0.024*L） 其中L为比色皿厚度。

7.由于核酸和蛋白质在320nm处没有吸收值，股可用于测定灰尘等的干扰。