Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达_李红雨

第36卷第5期第633页2007年10月　　　　华中科技大学学报(医学版)Acta M ed Univ S ci Technol H uazhong 　　　　Vol.36　No.5　P.633Oct.　2007

*国家重点基础研究发展计划(973)基金(No.2002CB513107),国家自然科学基金(No.30271358)资助项目

李红雨,女,1964年生,主任医师

△通讯作者,C orresp onding author.E -mail :dm a @tjh.tjm http://doc.guandang.net Pin1基因真核表达载体的构建及在

宫颈癌HeLa 细胞中的表达

*李红雨1,2　　朱　涛1　　周金华1　　徐　茜1　　胡春霞1

邓东锐1　　王世宣1　　卢运萍1　　马　丁1△

1

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科,武汉　4300302郑州大学第三附属医院妇产科,郑州　450052

摘要　目的　构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌

H eLa 细胞中的表达。方法　从人宫颈癌H eLa 细胞中,以R T -PCR 方法扩增出人Pin1基因全长cDN A 序列(CDS ),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGF P -C1,脂质体法转染H eLa 细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GF P -Pin1蛋白的表达。结果　RT -P CR 扩增出人Pin1基因;构建pEGF P -C1-P in1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌H eLa 细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GF P -P in1蛋白高表达;经G 418筛选获得单细胞克隆。结论　重组质粒pEGF P -Pin1体外转染H eLa 细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。

关键词　肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1;　质粒构建;　基因转染

中图法分类号　R737.33

Construction of pEGFP -Pin1Recombinant Plasmid and

Its Expression in C ervical Cancer C ell Line

Li H ongy u 1,2,Zhu T ao 1,Zho u Jinhua 1et al 1Department of Obstetrics and Gy necology ,Tongj i Hosp ital ,Tong ji Medical College ,

　　H uazhong University o f Science and Technology ,Wuhan 430030

2Department of Obstetrics and Gy necology ,the Third A f f i liated

　　Hospital ,Z hengzhou University ,Z hengzhou 450052

A bstract 　Objective 　T o construct a vector co ntaining huma n peptidy l -pro ly l cis /trans isome rase Pin1with g reen fluores -cence pro tein as the repo r ter gene ,and then to o bserv e its ex pr essio n in HeL a cells.Methods 　T he CDS of P in1w as amplified from H eLa cells by RT -PC R ,then lig ated with pEG F P -C1to for m reco mbinant plasmid pEG FP -Pin1and transfected into HeL a cells.G FP -tagg ed Pin1subcellula r lo calizatio n w as analyzed by fluore scent micro sco py ,and the G FP -Pin1w as detected by im -munoblo tting.Results 　T he r eco mbinant plasmid pEGF P -Pin1wa s constructed and tr ansfected into HeL a cells succe ssfully.Pin1lo ca lized almost e xclusive ly in the cell nucleus speckles and concentra ted at discrete structure s.T he G FP -Pin1wa s stro ng ly e xpressed in HeL a cells.T he stable transfected clone w as selected by G418.Conclusion 　Reco mbinant plasmid pEG FP -Pin1w as effectively expre ssed af te r being tr ansfected into He La cells ,w hich pro vided the lab suppo rt fo r further study on Pin1.

Key words 　peptidy l -pro ly l cis /trans isomer ase ,PP Iase P in1;　plasmid co nstr uction ;　g ene tr ansfectio n

　　Pin1主要调节有丝分裂相关蛋白酶,对细胞增

殖和恶性转化起着非常重要的调节作用。我们前期

研究显示:Pin1在宫颈癌组织中存在过表达,从正

常宫颈到宫颈上皮内瘤样病变(CIN )再到浸润癌的

过程中Pin1蛋白表达逐渐增强;Pin1过表达与Cy -

clin D1、Ki67表达呈显著正相关[1-2]。提示Pin1可

能通过调控Cy clin D1表达诱发细胞转化和增殖失

控,参与宫颈癌发生发展。为研究Pin1基因功能,我们应用Clontech 公司经定点突变技术改造成功的GFP 突变型真核表达载体pEGFP -C1,将新基因Pin1cDNA 开放阅读框与EGFP 的C 末端融合,成功构建了重组真核表达载体,转染宫颈癌H eLa 细胞并检测其表达,为进一步对Pin1在宫颈癌发病中作用和机制的研究奠定实验基础。1　材料与方法

1.1　材料与试剂宫颈癌H eLa 细胞株购自美国典型物种保藏中

心(Am erican Ty pe Culture Collection,ATCC),由同济医院妇科肿瘤实验室传代培养。DM EM培养液为Gibco(Invitro gen美国)公司产品,H epes和胰蛋白酶为美国Sig ma公司产品,新生牛血清为杭州四季青公司产品。增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1购自美国BD Biosciences Clontech公司,在大肠埃希菌DH5-α株中扩增。脂质体转染试剂Lipofectam ine2000为美国Invitrogen公司产品。T4DNA连接酶及T rizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),oligo-dT、耐热DNA聚合酶,质粒抽提试剂盒均购自美国Pro mega公司。PC R产物纯化试剂盒QIAquik PCR Purification Kit购自荷兰QIAGEN公司。限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ购自大连宝生物公司。兔抗人多克隆抗体Pin1、鼠抗人单克隆抗体β-actin购自美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔、兔抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz 公司。增强化学发光显色系统ECL购自以色列Bi-o logical Industries Kibbutz Beit Haemek公司。PCR引物合成及DNA测序由美国Invitro gen公司上海分部完成。

1.2　方法

1.2.1　PCR引物的设计及目的基因片段的获得　根据GeneBank中报道的Pin1基因(No. BC002899)cDNA序列的开放阅读框架,结合BD Biosciences Clo ntech公司载体说明书,Oligo软件优化设计出上、下游引物,在上游引物中加入Eco R Ⅰ酶切位点,下游引物中设计了B am HⅠ酶切位点,由Invitrog en公司合成。正向引物序列:5′-AGGGAAT TCGA TGGCGGACGAGGAGAAGCT -GC-3′,反向引物序列:5′-CA TGGA TCCGCTC-CCCACCC TCAC TCAG TGC-3′,从H eLa细胞RNA中RT-PC R扩增出Pin1基因全长cDNA序列。宫颈癌H eLa细胞呈贴壁生长,培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DM EM完全培养液,置于含5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中培养。取对数生长期、状态良好的H eLa细胞,Trizo l TM试剂一步法提取细胞总RNA,取5μg总RNA用M-M LV逆转录酶进行逆转录, 50μl反应体系PCR扩增Pin1基因全长cDNA序列。反应条件:94℃,预变性5min;94℃,变性30 s;58℃,退火60s;72℃,延伸90s,30个循环;72℃,末次延伸7min,4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察。

1.2.2　PC R产物纯化及限制性酶切　取100μl上述PCR产物,按QIAquik PCR Purification Kit说明书操作,纯化目的基因片断。取少量纯化产物测浓度,取30μg DNA,配制100μl反应体系,双酶切纯化的PCR产物及pEGFP-C1载体。将上述酶切产物再次纯化,测浓度,琼脂糖凝胶电泳,若杂带多再行玻璃奶回收纯化,按玻璃奶回收试剂盒说明书操作。

1.2.3　DNA片断定向连接及重组质粒转化大肠埃希菌　取上述纯化产物,按质粒∶目的片断1∶3～5摩尔比进行连接,连接体系20μl,室温3h,65℃温育10min终止酶反应 …… 此处隐藏：7312字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……