第四章 基因工程的主要技术及其原理【1】

第四章 基因工程的主要技术及其原理

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第四章 基因工程的主要技术及其原理第一节 DNA和RNA的提取和纯化

第二节 凝胶电泳第三节 核酸和蛋白质的分子杂交

第四节 聚合酶链式反应技术第五节 DNA序列分析

第六节 基因定点诱变第七节 DNA与蛋白质互作分析

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息 分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的

提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则 保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高 控制一定的pH值范围(pH值5-9) 保持一定的离子强度 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷 酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中 需加核酸酶抑制剂。

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙

二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；阴离子型表面活性剂： 如SDS,该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋 白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复 合物在高盐溶液中沉淀。

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化RNA酶(RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、 耐碱，不宜失活。 皂土(bentonite )

作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase,使其失活。肝素 复合硅酸盐(Macaloid)

RNase阻抑蛋白(RNasin)氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化RNA酶(RNAase)抑制剂

DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。

使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度 比使蛋白质变性的浓度大100~1000倍。 容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 剧毒。

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第一节 DNA和RNA的提取和纯化一般程序 1、供体的核酸分离供体细胞培养

收集(菌体)细胞细胞破碎

分离总DNA

分离细胞器

分离总RNA

分离细胞器DNA

RNA poly(A)RNA 特异性RNA

染色体DNA(组建基因组文库)

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一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DN

A的提取 差速离心结合SDS裂解法

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一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-CTAB法原理(植物DNA提取经典方法) CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六 烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞 膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的， 通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入 乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此 在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度 不要低于15℃。

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一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方组份 终浓度 Tris-HCl EDTA (pH8.0) (pH8.0) 100 mM 20 mM NaCl 1.4M CTAB β-巯基乙醇

2%(W/ V)

0.1%(V/V) 使用前加入

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

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一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方Tris-HCl (pH8.0) 100 mM EDTA NaCl (pH8.0) 20 mM

组份终浓度

CTAB

PVP40

β-巯基乙醇2%(V/V) 使用前加入

1.4M 3%(W/V) 5%(W/V)

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成

一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

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一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料 裂解液 酒精沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

DNA溶液

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

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一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA- SDS法原理

SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55~65℃)条件 下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使 蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇 沉淀水相中的DNA。 SDS法DNA提取缓冲液组份 终浓度 Tris-HCl (pH8.0) 10 mM

EDTA (pH8.0)20 mM

NaCl 0.4M

SDS 2%

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一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图(以动物组织为例)动物组织 抽提 离心洗涤

组织匀浆

上层溶液

干燥溶解

细胞裂解

酒精沉淀

DNA溶液

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一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法 根据细胞裂解方式的不同有： 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法