TaKaRa-染色体步移试剂盒说明书

Takara Code：D316

Genome Walking Kit

（10次量）

宝生物工程(大连)有限公司

目 录

内 容

● 制品说明 ● 制品内容 ● 保 存 ● 试剂盒原理 ● 特异性引物的设计

● 实验时需要自备的其他主要试剂 ● 实验操作流程 ● 实验操作方法 ● 注意事项

● 使用Control Template时的实验例 ● 使用小麦基因组DNA时的实验例 ● Q&A ● 参考文献

码1 1 2 2 3 3 3 4 6 6 8 10 11

页

● 制品说明

染色体步移技术（Genome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：

1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；

2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

3. 鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

以PCR技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。

本试剂盒是一种根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列的试剂盒。相对于其它传统方法，本试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。此外，本试剂盒中还含有Control DNA及Control Primer，可以方便进行Control实验。

● 制品内容（10次量）

1. AP1 Primer（100 pmol/μl） 2. AP2 Primer（100 pmol/μl） 3. AP3 Primer（100 pmol/μl） 4. AP4 Primer（100 pmol/μl）

5. Control Template（100 ng/μl）*1 6. Control Specific Primer SP1（10 pmol/μl）*2 7. Control Specific Primer SP2（10 pmol/μl）*2 8. Control Specific Primer SP3（10 pmol/μl）*2 9. TaKaRa LA Taq®（5 U/μl） 10. 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 11. dNTP Mixture（2.5 mM each）

* 1 Control Template 是Human HL60来源的基因组DNA。

* 2 Control Specific Primers是根据人基因组中的ALDOA基因设计的特异性引物。

【引物序列】

-1-

12. 6×Loading Buffer

30 μl 30 μl 30 μl 50 μl

10 μl

10 μl 10 μl 10 μl 25 μl 1 ml 400 μl 1 ml

● 保 存： -20℃。

● 试剂盒原理: 以使用兼并引物AP1为例。

图1. Genome Walking Kit的实验原理图

-2-

● 特异性引物的设计要求

特异性引物设计原则：

根据经过验证的已知序列区（最好不少于500 bp）设计三个特异性引物（见上图）：设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60~100 bp为宜。引物设计原则：引物的长度为22~26 nt，GC含量45~55％，Tm值60~70℃，引物Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41（G/C）%×100 - 650/L（引物碱基数）。其他要求和普通PCR反应用引物相同。

● 实验时需要自备的其他主要试剂

基因组DNA 提取试剂，如：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0（Takara Code：D824A）。

PCR 产物凝胶回收试剂，如：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0（Takara Code: D823A）。

● 实验操作流程

-3-

● 实验操作方法

1.

基因组DNA的获取。

基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组DNA（例如： 只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA一定不要污染，所需的DNA量不要少于3 μg。

2. 已知序列的验证。

在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。

3. 特异性引物的设计。

根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。

4. 1st PCR反应。

基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际用量参考下面的注*1），以AP Primer（四种中的任意一种，以下以AP1 Primer为例）作为上游引物，SP1 Primer为下游引物，进行1st PCR反应。

① 按下列组份配制1st PCR反应液。

② 1st PCR反应条件如下： 94℃ 1 min 98℃ 1 min 94℃ 30 sec

60~68℃*2 1 72℃ 2~4 min*3 94℃ 30 sec； 94℃ 30 sec； 94℃ 30 sec； 94℃ 30 sec； 72℃ 10 min

-4-

25℃

3 min； 72℃ 2~4 min*3

60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3

60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles 44℃

1 min； 72℃ 2~4 min*3

5. 2nd PCR反应。

将1st PCR反应液稀释1~1000倍后，取1 μl作为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进行2nd PCR反应。 ① 按下列组份配制2nd PCR反应液。

② 2nd PCR反应条件如下：

94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3

94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3

15 Cycles 94℃ 30 sec； 44℃ 1 min ； 72℃ 2~4 min*3

72℃ 10 min

6. 3rd PCR反应。

将2nd PCR反应液稀释1~1000倍后，取1 μl作为3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进行3r …… 此处隐藏：7184字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……