人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证

构件pbCNCS/LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明：小鼠受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂,整合率12.5%)。构件产生的3只母鼠和4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白(hLF)用ELISA方法检测,表达量分别为3.8、2.8、0.9mg.mL-1,4号后代3只

第 3 2卷第 3期 21 0 1年 9月

扬州大学学报 (业与生命科学版 )农J ur a fYa g h u Unv r iy ( rc lu a n ieSce eEdto ) o n lo n z o ie st Ag iut rla d L f inc iin

V ol32 N o _ .3Se p.2 011

人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证袁玉国，安礼友，于宝利，杨廷佳，成勇(州大学兽医学院/苏省转基因动物制药工程研究中心，江苏扬州 2 50 )扬江 20 9

摘

要：构件 p C C/ 3 b N S I 6经微注射获得转基因小鼠，时为了准确筛选出整合的单克隆细胞，加 1个 C e L x— F同增 r/ o P G P N o系统构建成 p P M,其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明：鼠受体妊娠率 2 .,仔 F—e A L将小 85产 3个，C 2 P R整合检测 4只阳性 (旱、舍，合率 1 .%) 3 1整 2 5。构件产生的 3只母鼠和 4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白 ( L ) E IA方法检测，达量分别为 3 8 2 8 0 9mg mL,号后代 3只母鼠表达量分别为 4 2 3 9 h F用 LS表 .、 .、 .一 4 .、.、 36mg 。构件 p L片段转染细胞后， G 1选，取单克隆扩大培养，中 8 P R阳性克隆细胞荧光 . mI~ AP M经 4 8筛挑其株 C显微镜观察 10都有 GF 0 P的表达。以上结果证实，双启动子能调控外源基因在乳腺中特异高水平表达 h F双标记基 L,

因可提高筛选阳性供核细胞的准确性，为进一步作体细胞转基因克隆奠定基础。这关键词：乳铁蛋白；标记基因；双启动子；小鼠；儿成纤维细胞；光蛋白人双胎荧 中图分类号： 72 Q 8;S】 8 8文献标志码：A 文章编号：1 7—4 5 ( 0 1 0—0 0 0 6 1 6 2 2 1 ) 3 0 6— 5

Co t u to fm a ma y g a d s c fc v c o o ns r c i n o m r l n pe ii e t r f r e p e so fhu a a t f r i x r si n o m n l co e rnYUAN -u Yu g o,AN L

。 o,YU a -i iy u B ol,YANG n -i,CHENG n Tigja Yo g(,a g uPr vReeCe o i a s e ei n o a mig/Col f Ve d,Y n z o i .in s o s n f rAn t Tr n g n ssa d Biph r n a l t o Me a g h u Unv,Ya g h u 2 5 0,Ch n ) n zo 2 0 9 i a

AB T S RAC T:To s r e r n g n c d n r c l o u la r n f r t e c s e t f L x - r - P Ne s 1 a e o c e n ta s e i o o e l f r n c e r t a s e, h a s te o o P c e GF - o wa i t d t s g

3 n V4 o y sq e c fp CNCS LF 6t u r d cn AP e d S 0 p lA e u n eo b/ 3 h sp o u igp LM .F rizd mo s g s(CR)we emirijce e t ie u ee g I l r conetd

wi h x rs i a st f b N S L 3 n rn fre t su op e n n mae.Th rg a c ae f s u t t ee p e s n c set o C C/ F 6a dta s rdi op e d - rg a t e l h o e p e n f s ep e n n yr t o e— p

d p enn ymi sw r 8 5 a d 3 n 3fu dr c r b r epcie .4(旱，1 o rg a c c ee . n, 2a d4 o n e ewee onrs et l e 2 mi vy 3舍)ta sei mi r rng nc c wee ep stv h c e y PC a d t e i t g a in r t r 2 5 . F c r m l r o r n g n c Th x r s in o i e c e k d b R n h n e r t a e we e 1 . i o 1 mie fo mae we e n tt a s e i. e e p e sol v lofhLF r .8, 8, .9 g m L i he G O ie a 4 e e we e 3 2. 0 m n t m c nd .2, 3 9, 6 g m L一 i he m i o F1 ie of . 3. m 1 n t l f 3 m c k

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u e c h c e v ELI A. F t 1f r b a tc l r r n fc e t mma y g a d s e i c 1e p e so n mb rGO mie c e k d b S e a i o l s e l we e ta s e t d wi ma b s h r ln p cf a x r s in ive t A PLM nd t n s r e d w ih G41 corofp a he c e ne t 8. The sng ec o s s e td a d e a e i l olny wa elce n xp nd d. G e m i NA e e a a— no cD w r n

ls d b CR.8 l e f f t lf r b a t c l x r s e P a d t e e t a s e i el u d b s d t r d c iF ye yP i s o ea i o l s el e p e s d GF n h s r n g n c c l wo l e u e o p o u e h n b s s t a s e i o t Th s e u t n ia e h t mi r mo e o i e t r n g n cg a . e e r s ls i d c t d t a l p o t r c mb n d wih CM V o l ie t h g x r s i n o L k c u d d r c i h e p e s f h F o c DNA p cf al o t ema s e i c l t h mma y g a d i h r n g n cmie a d t e d a s lc a l ma k rg n s o APLM o l e i y r l n t et a s e i c n h u l ee t b e n r e e e fp c udbus d t r e o p odu e ta n n cdo r c ls f r nu la r nser c r ns ge i no e l o ce r ta f .

KEY ORD W S:h ma a t f r i;d a e e t b e ma k r g n s u l r mo o s u n l co e rn u l lc a l r e e e;d a o t r;mie ea i r b a tc l;GFP s p c;f t lf o l s e l b

人乳铁蛋白是一种分子质量约为 8 u的糖蛋白，有广谱抗菌、 Ok具抗病毒、炎症、节骨髓生成及抗调免疫调节等多种功能，人类保健和疾病防

治等方面起着重要的作用，在目前有多家大型研究机构及学者用不同的乳蛋白调控序列进行了相关的研究工作，但在动物上获得理想的蛋白表达水平例子较少，表收稿日期： 0 1—0—1 21 1 5

基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项 ( 0 9 X 80—0 B;江苏省科技支撑计划项目 ( E 0 9 2 ) 20 Z 0 0 80 9 ) B 2 03 8;国家自然科学基金资助项目( 10 8 1 3 1 17 )

作者简介：袁玉国( 9 8 1 7一 ),男，江西分宜人，州大学兽医学院讲师、博士，主要从事动物胚胎工程与转基因克隆动物研究。扬*联系作者，Emal zd x p bi. zj. n— i:y. y@ u l y.sc c