siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY

RNAi 产品使用手册

上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介

A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程

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C. RNAi 实验所需试剂

D. 上海吉玛 RNAi 相关产品

Ⅱ. siRNA设计

A. 哺乳动物siRNA设计

B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据

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Ⅲ. siRNA 对照

A. 普通阴性对照

B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照

E. 避免off-target对照

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Ⅳ. siRNA 转染

A. siRNA 转染的方法

B. Lipofectamin2000 转染试剂

C. Lipofectamin2000适用的细胞类型 D. 转染前细胞培养

E. Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F. 贴壁细胞转染程序

G. 悬浮细胞siRNA转染程序

H. DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法

J. siRNA转染常见问题与建议

A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测

C. Real-Time PCR 结果分析

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Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测

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Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测

A. western-blot原理

B. western-blot操作步骤 C. western-blot上样液的制备 D. western-blot常用试剂的配制

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Ⅶ. RNAi实验常见问题解答

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Ⅰ. RNAi 简介

A. RNAi实验原理

RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

B. RNAi实验流程

C. RNAi实验所需试剂

试剂种类 试剂用途

与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补

转染试剂 如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染

试剂Lipofectamin2000，电穿孔法等

实验对照 包括阴性和阳性及Mocking control

基因表达的检测方如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用

western blot 法

D. 上海吉玛 RNAi 相关产品

普通siRNA Oligo

化学修饰siRNA Oligo

荧光标记siRNA Oligo

siRNA oligo

siRNA阴性对照

siRNA 阳性对照

RNAi 转染试剂

siRNA 转染

RNAi表达 载体法

shRNA 表达载体

上海吉玛 siRNA Oligo 是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA冻干粉的产品形式提交给用户。

上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA作用时间相比，上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。

荧光标记siRNA oligo可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNA还可用于siRNA细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。 上海吉玛 RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。荧光容易拍摄，它有很好的pH耐受性，因而在活细胞中更稳定。

上海吉玛 RNAi positive control用于确定实验中转染、RNA提取和检测方法的可靠性。上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、Luciferase GL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、Cyclophilin B等。

RNAi转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse活性，细胞毒性低。适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清培养基中也能表现高转染效率； 4℃下可长期保存。

上海吉玛 shRNA表达载体的特点是：克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1，可形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳定转染细胞系；GFP报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi发生位点。上海吉玛现可提供8种 shRNA表达载体，详见公司总目录C-6页。

核酸 抽提

基因 表达 检测

取；无论是小量的细胞（5×10）或组织（50-100mg）

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还是大量的细胞（10）或组织（>1g）都可得到出色的结果；操作简便，可实现RNA的快速抽提。Enzol 试剂是用于哺乳动物基因组DNA 抽提的试Enzol RNA Extraction

剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNAReagent

提取。通常使用本试剂，从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA，从106-107Hela细胞可以抽提到约25微克基因组DNA，是一种简单、快速、高效、经济的方法。

本试剂盒可以用来优化siRNA转染条件，也可作RNAi-Startup GAPDH

为RNAi实验的内参使用。荧光标记的dsRNA可Control Kit

直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR方法准确评价转染前后GAPDH基因的RNAi抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。

荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染情况；RNAi-Startup GAPDH

包含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照；应用Basic Control Kit

Real-Time PCR评价转染前后GAPDH基因活性时,本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent（目录号QSG-070）。

使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNARNAi Gene-Knockdown

及转染效率评价”到“实时RT-PCR验证RNAi Easy Kit

Knockdown效果”的全部过程；荧光标记的dsRNA可直观的观察细胞转染情况；内含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照及 PCR扩增引物和探针，可应用定量PCR方法直观评价转染效率及验证GAPDH的RNAi抑制效果；可作为RNAi实验的阳性和阴性对照使用。

哺乳动物细胞中长链的双链RNA（dsRNA）能够RNAi-Startup IFN

Response Basic Control Kit 诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。如果

您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应，则可用本试剂盒进行验证；应用Real-Time PCR检测非特异性IFN效应时，本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent（目录号QSG-070）。

如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异RNAi-Startup IFN 性的IFN效应，则可用本试剂盒进行Realtime PCRResponse Control Kit

验证；同时检测PKR, OAS-1和 hStat1三个IFN效应基因并提供GAPDH管家基因对照；检测灵敏度高，结果直观且易于判断。

常备的RNAi管家基因Control 上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi 实验

Control Kits，以方便广大科研工作者开展RNAi实试剂盒

验。详见上海吉玛产品目 …… 此处隐藏：11483字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……