真菌的常规检验法

真菌的常规检验法

实验室检查：

?标本采集分离培养

?直接镜检生化反应

?染色镜检免疫学试验

一、临床标本的采集

?1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。

2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。

?3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。

4．脓汁及渗出物。

二、检验方法

（一）标本直接检查法

不染色标本检查

染色标本检查

（二）培养检查

（三）鉴定

①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。

②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）

③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。

④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

微生物学检查步骤：

取患部标本

（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化

→镜检（观察菌丝和孢子）

直接镜检的意义

①有诊断意义，如浅部真菌病等；

②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；

③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。

直接镜检的局限性：

①阴性结果不能排除真菌感染；

②有假阳性结果。

因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。

2. 染色标本检查

?（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。

?（2）乳酸酚棉蓝染色

?（3）糖原染色：

?又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。

?（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色

?（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。

?（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

（二）培养检查法

?本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。

①菌落性质：酵母菌还是霉菌；

②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；

③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；

④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。

标本培养观察

标本→沙保培养基→观察菌落形态、假菌丝

标本→玉米粉琼脂培养基→观察厚垣孢子

2、培养方法

?接种工具为接种针、接种钩、接种环、接种铲（刀）?（1）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。?（2）大培养：用平皿或培养瓶培养。

?（3）小培养可观察结构特征及发育的全过程。? 1）玻片小培养法

? 2）郭可大钢圈小培养法：

?材料：培养基、钢环（用铁环或废电线的铝丝制成）、载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。

钢圈小培养法

先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，接种在培养基表面。

将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜检，一般约7ｄ即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。

真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落形态是鉴别真菌的判断依据。

动物实验

目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。

如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮质部位有白色脓疡。

（三）真菌的鉴定

1.真菌的生化反应

用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。

1）糖(醇)类发酵试验 37℃，观察糖发酵情况。

2）同化碳源试验含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长圈。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。

3）同化氮源试验同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。

4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。

5）尿素分解试验石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。

6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色

7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等

2、芽管试验