淋巴道转移舌鳞癌细胞RECK、MMP-2和MMP-9表达的动物实验研究

淋巴道转移舌鳞癌细胞RECK、MMP-2和MMP-9

表达的动物实验研究

作者：姚金光，李龙江，邝晓聪，温冠媚，李祖云，李俊 作者单位：右江民族医学院口腔科学教研室，广西 百色 533000

【摘要】 目的 在动物模型水平探讨RECK表达水平与

MMP-2 和 MMP-9的关系。方法 采用爪垫注射Tca8113细胞建立舌鳞癌淋巴道转移裸鼠模型，收集4周后回流淋巴结，采用免疫组化、Western blot方法检测RECK、MMP-2、MMP-9水平。结果 8例舌癌淋巴结转移模型裸鼠均有MMP-2、9表达，细胞染色呈较强的阳性，而RECK未发现较强阳性细胞出现，只有可疑的阳性细胞散在出现;淋巴结转移的舌癌细胞RECK表达明显低于用于移植的Tca8113舌癌细胞(t=7.78，P<0.01);MMP-2、9表达水平均显著高于用于移植的舌癌细胞(t分别为3.06，2.25，P<0.01或0.05)。结论 动物体内实验进一步证实RECK低水平表达可增加舌癌侵袭转移机率，其调控机理可能与RECK抑制MMP-2、9表达有关。

【关键词】 舌;癌，鳞状细胞;RECK;基质金属蛋白酶;肿瘤转移;淋巴;模型，动物;小鼠

An animal-based experiment on RECK，MMP-2 and MMP-9 expression in lymphatic metastatic tongue carcinoma cells

YAO Jin-guang，LI Long-jiang，KUANG Xiao-cong，WEN Guan-mei，LI Zu-yun，LI Jun

(Department of Stomatology，Youjiang Medical College for Nationalities，Baise，Guangxi 533000，China;Department of Oral and Maxillofacial Surgery，West China College of Stomatology，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041，China; Department of

Pathophysiology，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China; Department of Pathology，Guangxi Medical

University，Nanning，Guangxi 530021，China)

Abstract： Objective To approach the relationship between the expressive level of the reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) and matrix metalloproteinases (MMP-2 and

MMP-9) by nude mice model-based experiment. Methods The tongue

carcinoma lymphatic metastasis model of the nude mouse was established by injecting Tca 8113 cells into the nail pad.We collected the regurgitant lymph nodes after 4 weeks and detected RECK，MMP-9 and MMP-2 levels by immunohistochemistry and Western blot assay. Results There were 8 nude mice of the tongue carcinoma lymphatic metastasis model expressing MMP-2 and MMP-9，and the cell staining was also strong，while there were not positive staining cells in the RECK detection，and only some scattered suspicious positive cells were found.RECK

expressive level of lymphatic metastatic tongue carcinoma cell decreased significantly and were lower than the level in transplanted Tca 8113 cells (t=7.78，P<0.01); while the expressive levels of MMP-2 and MMP-9

were both higher than those of the control group (t=3.06 and 2.25，

respectively，P<0.01 or 0.05). Conclusion The animal in vivo experiments confirmed that low expression of RECK could enhance invasiveness and metastasis of tongue carcinoma，the regulating mechanism may be related to RECK inhibiting MMP-2 and MMP-9 expression.

Key words： tongue; carcinoma，squamous cell; the

reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK); matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9); neoplasm metastasis; lymph; models，animal; mice

舌鳞癌淋巴道转移是口腔恶性肿瘤的研究热点之一，与临床预后密切相关，其中基质金属蛋白酶家族(MMPs)在舌鳞癌侵袭、转移中扮演重要角色。初步的细胞学和临床研究表明[1]，RECK基因可以通过抑制MMP-2、9的活性，阻碍、抑制癌细胞转移，构成影响癌细胞转移的调控体系。本研究利用舌鳞癌淋巴道转移动物模型，旨在通过动物实验进一步证实RECK基因与MMPs的相互关系，并从中探讨舌癌淋巴道转移的生物学特点。

1 材料与方法

1.1 舌鳞癌淋巴道转移动物模型的建立 参考爪垫注射癌细胞建立鼻咽癌淋巴道转移模型方法[2]，用爪垫注射Tca8113细胞建立舌鳞癌淋巴结转移裸鼠模型，具体操作如下：取经处理的1×107个/ml Tca 8113细胞悬液，选择裸鼠四肢的爪垫内侧4个点进行皮下注射，总体积为0.5ml，观察动物模型的一般情况，4周之后取回流淋

巴结(腹股沟、腋下等部位)检测相关基因的表达水平。

1.2 实验分组、取材

1.2.1 实验分组 (1)转移舌鳞癌细胞组：选用裸鼠11只进行淋巴道转移动物模型的建模，动物成模与入选标准：①肉眼观发现回流区域淋巴结肿大，或者H-E染色确诊或MMP-2、9染色阳性;②动物模型的淋巴结二代舌癌细胞悬液分离、纯化培养发现舌癌细胞。(2)舌鳞癌Tca8113细胞对照组：用于与转移的舌鳞癌细胞作对照。(3)正常裸小鼠对照组：取淋巴结做对照，5只。

1.2.2 实验取材与样品制备 转移舌鳞癌细胞组(成功建模后)与正常裸鼠对照组，在小鼠四肢的爪垫注射美蓝，对四肢和腹腔的淋巴回流区域淋巴结显色，并进行取材。取下的淋巴结做两种处理，一是多聚甲醛固定，用于H-E染色及免疫组化染色，二是制备淋巴结细胞悬液，采用肿瘤细胞分离液进行肿瘤细胞的初步分离，制成1×106个/ml浓度细胞悬液，用于Western blot检测。舌鳞癌Tca 8113细胞对照组，消化培养细胞，制成1×106个/ml浓度细胞悬液，用于Western blot检测。

1.3 实验方法

1.3.1 H-E检测 检测标本为转移舌鳞癌细胞组与正常裸鼠对照组的淋巴结组织切片。

1.3.2 免疫组化检测 RECK，MMP-2，MMP-9采用小鼠抗人RECK单抗(美国R &D公司)，按1∶200比例用单抗专用稀释液稀释，二抗检测采用广泛通用型超敏试剂盒，显色系统采用DAB系

统，分别为麦新公司与Gibco BRL公司产品。操作严格按试剂盒流程。检测标本为转移舌鳞癌细胞组与正常裸小鼠对照组的淋巴结组织切片。

1.3.3 Western blot检测 抗人MMP-9单抗、MMP-2单抗(晶美公司)，RECK小鼠抗人单抗(美国R &D公司)，HRP标记羊抗鼠二抗与免疫印迹发光底物(Pierce公司)，显影底片(柯达公司)，检测淋巴道转移舌鳞癌细胞与体外培养舌鳞癌细胞。

1.4 统计学处理 计量数据以x±s表示，采用t检验。 2 结果

2.1 舌癌淋巴结转移模型的一般情况与H-E检测情况 舌鳞癌淋巴道转移动物模型的裸鼠的活动、精神状态、进食等情况比正常裸鼠稍差，在淋巴回流的腹股沟、腋下等区域，4周后转移的淋巴结为绿豆或黄豆大小，质地偏硬，有粘连感，活动度尚可，转移发生率为72.72%(8/11)。取肿大淋巴结，H-E染色后在光镜下发现：转移的癌细胞多积聚在淋巴结的髓窦区域，其它区域也有散在分布，生长方式以灶性或散在细胞存在，转移细胞形态异型性较大，染色质较深，有较丰富的胞浆，而正常裸鼠对照组无舌鳞癌细胞，见图1。

2.2 免疫组化检测转移模型中淋巴结转移癌细胞RECK、MMP-2、9表达情况 8例舌癌淋巴结转移模型裸鼠均有MMP-2、9表达，细胞染色呈较强的阳性，细胞分布呈散在或 …… 此处隐藏：5672字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……