定量PCR实验要素和数据处理(AB)

实验要素与数据处理

定量PCR实验要素

定量PCR实验要素

检测对象标准曲线监控系统故障监控污染校准生物学误差校准物理误差降低其余误差

样品标准品阳性对照阴性对照阳性内对照 (IPC)参比荧光 (ROX)重复实验

对样品的要求

DNA纯度：OD260/OD280=1.8,1.6-2.0之间 DNA用量：0.05 ng– 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng总RNA反转录的cDNA取1uL样品中PCR抑制物尽可能少核酸的完整度样品的物理特性及合适的处理方法

标准品

目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的函数关系要求： 选取具备代表性的标准品组织样？灭活病毒颗粒？基因组DNA?质粒？体外转录RNA?纯化的PCR产物？ 绝对量已知(拷贝数、质量、浓度) 大于等于5个标准品 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% CT= - k lgX0+ b

与样品的性质尽可能接近；与样品相同的扩增条件(PCR体系、耗材、同一次扩增)

标准品的准备

选择目标→提取/PCR→纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释所得CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法：1. 2. 3. 4.

原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v

切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接稀释为标准品 ii、iii、iv、v!“9ul+ 1ul” VS“90ul+10ul”?

标准品的单位

标准品的单位决定样品定量结果的单位

根据最终目的选择标准品单位

如果要求测定样品的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的 DNA片段

如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)],如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合 DNA;切不可先抽好转基因DNA,再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA,再按重量比例混合(这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比)

各类实验对照设立各种PCR对照的意义：

两种容易混淆的阴性对照 无模板的阴性对照在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。

阴性样品的对照在样品制备过程中，加入已知的阴性样品(或水),并将提取物作为模板加入反应体系，参与整个实验过程。目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。

设立阳性内对照(IPC)的意义

IPC可以起到阳性对照的作用，以监控反应系统是否正常试剂、PCR程序、荧光采集、是否存在抑制

物……

IPC可以校准实验过程对定量结果的影响

核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞(或基因组)

将结果校正为以细胞(或基因组)为单位，不同样品之间才具有可比性 IPC通常选择管家基因，且它与样品DNA具有相似的扩增效率校准方法：校准方法：[目的基因]/[内参]=均一化的目的基因表达量

校准荧光ROX

ROX是一种荧光染料； ROX以固定的浓度配制在Master Mix中 ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关 ROX的功能：校准加样的误差(如试剂体积)、耗材质量(如管盖厚度、透光性能)、仪器稳定性(如孔间、批间波动)等的误差，监控反应体系 (是否存在样品的蒸发)。

Reporter Reference Reporter Reference

Rn= RFAM/ RROX

Rn

Rn

ROX校准增加数据精度

校准荧光ROX浓度对实验精度的影响

设置实验重复

样品和标准品都要设置重复重复次数须遵循统计学要求小样本统计n>6修正偶然误差

误差的校正 生物学方面的误差：IPC校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等

物理方面的误差：ROX校正加样的误差(如试剂体积变动)、耗材质量(如管盖厚度、透光性能不一致)所导致的光能损失、仪器稳定性(如孔间、批间温度的波动)的误差等

其余的误差：统计校正重复实验，取平均值

实验操作注意事项

实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区标准品的稀释最好使用独立的一套移液器；标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA;移液器使用带滤芯的吸头；加样时，不能用移液器混匀样品，应使用涡旋振荡器来混匀；先加阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对照； PCR管上不可用记号笔标记； PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面； PCR管或8联排管要平衡放置；反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启；采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响。