Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

基因组学与应用生物学，2011年，第30卷，第1期，第21－26页GenomicsandAppliedBiology,2011,Vol.30,No.1,21－26

研究报告ALetter

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

范丙友1*高水平2侯小改1胥华伟1史国安1孔祥生1

1河南科技大学农学院,洛阳,471003;2河南科技大学林学院,洛阳,471003*通讯作者,fanbingyou2005@http://www.77cn.com.cn

摘要隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3(AP3)在花瓣和雄蕊中特

异性地表达；与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。AP3基因编码转录因子，

研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此，AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-基于PCR技术，用高保真的KOD-psisthaliana)AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物，

plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子，并命名为pAtAP3，其Gen-Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%，与Col生态型拟南Bank登录号为FJ619533。

且该段序列的下游基因编芥BAC克隆T12E18(AL132971)9264~11030之间的碱基序列相似性达100%，

码AP3蛋白(CAB81799)，说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box，还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS，为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

关键词

拟南芥,Col生态型,APETALA3启动子,植物表达载体构建

MolecularCloningofPromoterofAP3GenefromArabidopsisthaliana(E-cotypeCol)andConstructionofPlantExpressionVector

FanBingyou1*GaoShuiping2HouXiaogai1XuHuawei1ShiGuo'an1KongXiangsheng1

1CollegeofAgriculture,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003;2CollegeofForestry,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003

*Correspondingauthor,fanbingyou2005@http://www.77cn.com.cnDOI:10.3969/gab.030.000021

AbstractBelongingtoMADS-Boxgenefamily,ArabidopsisfloralorganidentityBgeneAPETALA3(AP3)isexpressedinpetalsandstamensspecifically.AP3genewhichencodesatranscriptionfactorcontrolsthedevelop-mentofpetalsandstamensofdicotyledons,incombinationwiththeclassAandCgenes,respectively.ItindicatedthatthepromoterofAP3genewasaflower-specificexpressionpromoter.Therefore,cloningandcharacterizationofAP3genepromoterfromArabidopsisthalianawillhavesignificanteffectsontheorientedimprovementofthecommercialtraitsrelatedtotheflowersofornamentalplants.Here,apairofspecificPCRprimerswasdesignedaccordingtopromotersequenceofAP3geneofArabidopsisthaliana(ecotypeLer)reportedinGenBank(U30729).A1767bplongsequenceofAP3genepromoterwasisolatedfromArabidopsisthaliana(ecotypeCol)byusingPCRtechniquewithhigh-fidelityDNApolymeraseKOD-plus.TheGenBankaccessionofpAtAP3isFJ619533.OnlineBl2seqanalysisindicatedthatthesequencesimilaritybetweenpAtAP3andU30729was98%.ItalsoshowedthatthesequencesimilaritybetweenpAtAP3andthebasefrom9264to11030ofBACcloneT12E18(AL132971)ofArabidopsisthaliana(ecotypeCol)wasupto100%,anditsdownstreamsequenceencodedAP3

基金项目：本研究由国家自然科学基金(30740013)和河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2010GGJS－075)共同资助

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基因组学与应用生物学

GenomicsandAppliedBiology

protein(CAB81799),whichapprovedthattheclonedsequencewaspromoterofAP3geneofArabidopsisthaliana(ecotypeCol).OnlinePLACEanalysisrevealedthatpAtAP3containedbasiccis-elementsofpromotersuchasTATA-boxandCAAT-box.Italsocomprisedofseveralcis-elementslikeCArG1,CArG2,CArG3andanther-box,whichwereallrelatedtoflower-specificexpression.Moreover,plantexpressionvectorofpAtAP3::GUSwassuc-cessfullyconstructed,layingthefoundationforfunctionalcharacterizationoftheAP3promoterofArabidopsisthaliana(ecotypeCol).

KeywordsArabidopsisthaliana,EcotypeCol,PromoterofAPETALA3,Constructionofplantexpressionvector），这些生态型在基于对拟南芥(Arabidopsisthaliana)和金鱼草Columbia(Col)和Wassilewskija(Ws

(AntirrhinummajusL.)花同源异型突变体的研究，形态发育和生理反应方面存在很大差异(张振桢等,

到目前为止，Col生态型拟南芥AP3基因启动Coen和Meyerowitz(1991)提出了花发育的ABC模2006)。

型，随后该模型被Angenent和Colombo(1996)进一子尚未见报道，为此我们克隆了Col生态型拟南芥

在花发育的遗传网络中，花器AP3基因启动子(GenBank序列号FJ619533)并进行步扩充为ABCD模型。

官特征基因(floralorganidentitygene)决定花器官原了生物信息学分析，构建了pAtAP3::GUS植物表达基发育成萼片、花瓣、雄蕊或心皮。植物花器官B类载体，以期为深入阐明Col生态型拟南芥AP3基因

隶属于启动子的功能和机制奠定基础，并最终为定向改良特征基因APETALA3(AP3)编码转录因子，

MADS-Box基因家族。AP3基因在花瓣和雄蕊中特园林植物与花相关的商业性状积累资料。异性地表达，与A类特征基因和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育(Krizek和Meyerowits,1996)。启动子表达特性的分析显示了AP3基因启动子为花器官特异表达启动子(Verdonketal.,2008)。

应用生物技术对植物的重要商业性状进行遗传改良时，如果导入的异源基因在CaMV35S等组成型启动子介导下表达，就可能抑制转基因植物的生长和发育；而在花特异表达启动子的调控下，外源基因可特异性地在花器官中表达，一方面可增加区域表达量，另一方面也不会对转基因植株的发育带来不良影响；因此花特异表达启动子对园林植物商业性状的定向改良具有极其重要的应用价值(Fanetal.,2010;高水平等,2010)。目前Ler生态型拟南芥的AP3启动子已经被克隆(Kochetal.,2001)，特异位点突变分析(site-specificmutagenesis)表明CArG1、CArG2和CArG3等顺式元件与AP3基因的花特异性表达密切相关(Tillyetal.,1998)。在Ler生态型拟南芥AP3启动子的调控下，异源的农杆菌(Agrobacteriumtume-faciens)ipt(isopentenyltransferase,异戊烯基转移酶)基因能够在转基因矮牵牛(Petuniahybrida)花器官中特异性地表达，结果表明转基因矮牵牛花朵的直径及鲜重得到显著增加，而营养体的大小与非转基因植株相当(Verdonketal.,2008)，该研究为进一步应用花特异表达启动子定向改良园林植物与花器官相关的商业性状提供了理论和实践依据。在拟南芥众多

图1拟南芥AP3基因启动子的扩增产物

注:M:DNAMarkerⅢ;1~2:拟南芥AP3基因启动子扩增产物Figure1AgarosegelseparationofPCRproductofpAtAP3

1结果与分析

1.1pAtAP3的PCR扩增

以Col生态型拟南芥幼嫩叶片总DNA为模板，

用高保真的KOD-plusDNA聚合酶成功扩增出拟南芥A …… 此处隐藏：12226字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……