德国牧羊犬_干扰素基因克隆表达与抗病毒活性测定

ChineseJournalofVeterinaryMedicine 中国兽医杂志2008年(第44卷)第6期

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德国牧羊犬 干扰素基因克隆表达

与抗病毒活性测定

吴艳花1,2,汪 明1,吴志光1

(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;2.首都医科大学实验动物部,北京丰台100069)

摘要:利用RT PCR扩增德国牧羊犬 干扰素(CaIFN )的成熟肽。序列分析表明,CaIFN 的成熟肽cDNA由432个核苷酸组成,共编码143个氨基酸。构建载体pGEXT 6p 1/CaIFN 表达重组CaIFN ,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化后,得到近100%纯度的重组CaIFN ,其在犬肾细胞(MDCK)/猪水泡性口炎病毒(VSV)细胞系上的活性可达1.33 106U/mg。

关键词:德国牧羊犬; 干扰素;克隆;融合表达;抗病毒活性

中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:0529 6005(2008)06 0003 02

Molecularcloning,expressionandantiviralactivityanalysisof

CaIFN geneofGermanshepherddog

WUYan hua,WANGMing,WUZhi guang

1,2

1

1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China;2.SectionofLaboratoryAnimals,CapitalUniversityofMedicine,Beijing100069,China)

Abstract:UsingthetotalmRNAfromthelymphocytesofGermanshepherddogperipheralbloodasthetemplate,canineinterferon (CaIFN )genewasclonedandamplifiedbyRT PCR.SequenceanalysisshowedthattheCaIFN genewascomposedof432nucleotidesencodingamatureproteinof143aminoacidsandastopcodon.Highlyexpressedandpurifiedrecombinantproteinwasharvested.Antiviralassaysshowedthattheantiviralactivitywas1.33 106U/mginMDCK/VSVcelllines.

Keywords:dog;CaIFN ;clone;expression;antiviralactivityCorrespondingauthor:WANGMing 干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节功能的诱生蛋白,是哺乳动物主要的巨噬细胞活化因子。Hiummler等率先开始了犬IFN 基

[1][2]

因的研究(1987)。随后DevosK等和ZuckerK等(1992)也相继克隆了犬IFN 基因[3]。夏春、汪明等(1999)也克隆报道过德国牧羊犬和拉布拉多

[4]

犬IFN 基因序列。2002年杨琪、夏春等克隆了犬 干扰素的cDNA并实现了其在鼠骨髓瘤细胞(SP20)中的表达[5]。本文克隆了德国牧羊犬IFN cDNA,并用pGEXT 6P 1载体实现表达,表达干

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扰素活性达1.33 10U/mg。1 材料与方法

1.1 材料 德国牧羊犬外周血由王雷博士提供;

收稿日期:2007 03 08

作者简介:吴艳花(1978 ),女,讲师,博士,主要从事动物传染病和寄生虫病研究,E mail:wuyanhua_1005@http://

:, http://

Trizol ReagentTotalRNAIsolationkit购自In

vitrogen;generalRT PCRKit购自Promega;TaqPCR试剂盒、限制性内切酶Xhol 、BamH 均为TaKaRa产品;GlutathioneSepharose4B亲和层析柱购自PharmaciaBiotech。1.2 CaIFN 基因克隆、表达载体的构建和序列分析 无菌取德国牧羊犬外周血分离淋巴细胞,用刀豆素A(ConA,Sigma)诱导8h,收集淋巴细胞,PBS洗3次。按常规方法提取RNA,然后反转录。根据GenBank中已发表的CaIFN 序列(序列号AF126247)设计引物,上游引物为5! GGGATCCCAGGCCATGTTTTTTAAA 3!,下游引物为5! GGGCTCGAGTTATTTCGATGCTCTG 3!,以上述反转录产物为模板PCR扩增,用Xhol 和BamH 双酶切后与pGEXT 6p 1连接,酶切鉴定和PCR鉴定筛选为阳性的克隆进行测序,用

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1.3 重组CaIFN 蛋白表达与纯化 将测序正确的阳性重组菌株,进行IPTG诱导表达,经SDS PAGE和Westernblot鉴定正确后,大量表达。表达后的蛋白用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化。

1.4 重组CaIFN 抗病毒活性的测定 采用细胞病变抑制法,分别在CEF/VSV、MDCK/VSV细胞系上测定重组CaIFN 的抗病毒活性。将抑制50%细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位(U)。2 结果

2.1 CaIFN 的克隆及鉴定 PCR产物大小约为432bp,与预期大小一致,参见图1A。用Xhol 和BamH 双酶切鉴定结果与预期结果一致,见图1B。2.2 CaIFN 的序列分析 德国牧羊犬CaIFN 成熟肽基因全长432bp,编码143个氨基酸,含两个潜在的糖基化位点(图2实线部分)。将该序列与GenBank中已发表的序列(序列号AF126247)比较,

同源性为99.1%;其氨基酸同源性为98.6%。第187位A突变为G,350位T突变为C,使得第63位的天冬酰氨突变为天冬氨酸,117位的蛋氨酸突变成苏氨酸(图2方框部分),第99位和第297位分别有G到A和T到C的同义突变(图2虚线部分)

。

图1 CaIFN 的PCR扩增及酶切鉴

定结果

图2 德国牧羊犬CaIFN 成熟肽cDNA序列及对应的氨基酸序列

2.3 CaIFN 的表达、纯化 SDS PAGE结果如

图3所示,IPTG诱导株在41.7kD左右有一特异蛋白带(见图3A),由于CaIFN 的分子量约为15.7kD,GST的分子量约为26kD,因此所表达的融合蛋白质分子量为41.7kD。采用sepharose4B纯化后,得到高纯度的融合蛋白(见图3C)。Western blot结果(图3B)进一步证明表达蛋白的正确性。2.4 重组CaIFN 抗病毒活性的测定 重组CaIFN 活性检测结果表明MDCK/VSV细胞系上的活性明显高于CEF/VSV细胞系,分别约为1.33 105U/mg和1.33 106U/mg,说明CaIFN 具有明显的种属特异性。3 讨论

本研究克隆了德国牧羊犬CaIFN 基因,其氨基酸序列与AF126247相比,第63位的天冬酰氨突变成天冬氨酸,117位的蛋氨酸突变成苏氨酸,杨

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北京鸭CD8 分子克隆与表达

及其多克隆抗体制备

廖定为,唐秀山,蒋一男,张念之,夏 春

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

摘要:为了探讨鸭CTL免疫与病毒关系,本文用PCR技术从鸭cDNA文库中克隆了其CD8 基因(DuCD8 )。将DuCD8 成熟肽cDNA插入表达载体pQE30、构建了E.coliJM109(pQE30/DuCD8 )原核表达系。经诱导表达、蛋白纯化,制备了鼠抗DuCD8 多克隆抗体。结果表明DuCD8 成熟肽长645bp,编码214个氨基酸。与已报道的DuCD8 在氨基酸水平上的同源性高达99.0%。SDS PAGE证实重组DuCD8 (rDuCD8 )在JM109工程菌中的表达量可达15%。纯化的rDuCD8 分子量为26kDa。ELISA结果显示鼠抗rDuCD8 多克隆抗体效价为1 1280000。

关键词:北京鸭;CD8 ;表达;抗体

中图分类号:Q789 文献标识码:A 文章编号:0529 6005(2008)06 0005 02

Cloning,expressionandpolyclonalantibodiesproductionofPekingduckCD8

LIAODing wei,TANGXiu shan,JIANGYi nan,ZHANGNian zhi,XIAChun

(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

Abstract:TheduckCD8 chain(DuCD8 )wasamplifiedbyPCRmethodfromthecDNAofPeking

duck.Theexpressionplasmid(pQE30/DuCD8 )containingtheDuCD8 wasconstructed,andtrans formedintoE.colistrainJM109,w …… 此处隐藏：3627字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……