3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

多重PCR检测

中国卫生检验杂志2007年11月第17卷第11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17　No111959

【论著】

3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

蔡亦红,姚余有

(安徽医科大学,合肥　230032)

[摘要]　目的:建立快速检测食源性致病菌的多重PCR方法。方法:本研究根据肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素(Heatlabileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)的侵袭蛋

白A(invasionproteinA,invA)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigenH,ipaH),分

别设计了三对引物,预计PCR扩增的目的基因片段为194、279和435bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异

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性、敏感性分析以及建立L16(4)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和T,建立了快速检测肠毒性大肠埃希菌、方法:为:145pg/ml肠毒性大肠埃希菌的基因组DNA、100ng/ml、7DNA,与单基因PCR检测的灵敏度相同。:、检验周期短、特异性和灵敏度高,。[关键词]　多重;;福氏志贺菌

[中图分类号]　[　A　　　　[文章编号]　1004-8685(2007)11-1959-04

EstablishmentandapplicationofmultiplePCRfordiagnosingthreefood-bornebacteri2alpathogens

CaiYi2hong,YaoYu2you

(AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

[Abstract]　Objective:ToestablishandapplymultiplePCRfordiagnosingthreefood-bornebacterialpathogens1Methods:ThreepairsofprimershavebeendesignedaccordingtotheEnterotoxigenicE1coli(ETEC)heatlabileenterotoxinB(LTB),Salmo2nellatyphiinvasionproteinA(invA),ShigellaflexneriinvasionplasmidantigenH(ipaH)1AnticipatedPCRproductwas194,279and435bp1ThespecificityandsensitivityofPCRwereanalyzedforsinglegene1MultiplePCRmethodhasbeendevelopedfordi2agnosingETEC,Salmonellatyphi,Shigellaflexneriafteranalysisandoptimizationreactionconditionbyorthogonalexperimental

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designL16(4)1Results:ThesensitivityofmultiplePCRwas145pg/mlgenomeDNAforETEC,100ng/mlforSalmonellatyphi,7ng/mlforShigellaflexneri,whicharesameasthesensitivityofsinglePCR1Theresultswerestableinsimulatedexamination.Conclusion:ThemultiplePCRmethodisvaluableforexplorationandappliacation1

[Keywords]　MultiplePCR;Foodinspection;EnterotoxigenicE1coli;Salmonellatyphi;Shigellaflexneri

　　近年来,随着经济全球化进程的加快,食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因,食源性致病菌对人类健康造成极大危害,是食品安全的重大隐患。据WHO估计,发达国家每年约30%的人口患食源性疾病[1],在发展中国家情况更为严重,估计每年腹泻及其相关疾病有217亿病例,导致240万5岁以下儿童死亡[2]。食源性疾病可以侵犯任何人群,儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病,成为最主要的受害人群[3]。

肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE1coli,ETEC),伤寒沙门菌(Salmonellatyphi),福氏志贺菌(Shigellaflexneri)是引起食源性疾病的常见3种病原体[4]。这3种病原体感染人体都

[基金项目]　安徽医科大学校科研基金资助项目(522562)[作者简介]　蔡亦红(1980-),女,硕士,助教,主要从事卫生微

生物学研究。

会出现恶心、呕吐、腹痛等相似的症状,尤其是症状不典型者,

极容易被相互误诊,影响治疗而导致慢性感染或带菌者。因此,迫切需要对这3种病原体进行准确而快速的诊断。目前包括我国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多仍沿用传统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法,检验步骤繁琐,检验周期较长,而且检测的灵敏度也较低。尤其是在应对突发公共卫生事件上,不能够满足诊断及时、结果准确、敏感性和特异性高的要求[5]。

鉴于此,为了能够更快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控,本研究将以肠毒性大肠埃希菌的编码大肠杆菌不耐热毒素(Heatlabileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)的侵袭蛋白A(invasionproteinA,invA)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigenH,ipaH)作为研究对象,建立一种稳定的、高敏感性和特异性的多重PCR体系,对快速、准确的一次性检测食品中3种病原体感染状况进行探讨。

多重PCR检测

19601　材料与方法111　菌种

中国卫生检验杂志2007年11月第17卷第11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17　No11

液3μl,其余用去离子水补足,总体积50μl。扩增条件同上。

117　单管多重PCR的扩增条件优化

金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、伤寒沙门菌、福氏志贺菌、肠毒性大肠埃希菌由安徽医科大学微生物教研室和安徽省合肥市疾病预防控制中心提供。112　主要试剂及仪器

PCR扩增试剂购自上海Promega公司、DNA提取试剂盒购自上海赛百盛基因技术公司、100bpDNAladdermarker购自Takara宝生物工程(大连)有限公司、751型紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司、DYY-5型电泳仪由北京市六一仪器厂生产、Mastercycler梯度PCR仪购自Eppendorf公司。113　细菌的培养和基因组DNA的提取

将肠毒性大肠埃希菌接种于肠道菌增菌肉汤、沙门菌接种于SC增菌液、志贺菌接种于GN增菌液[6]中进行增菌,然后接种于EMB培养基上进行纯培养。挑一单个菌落复接种到30ml相应增菌液内增菌,提取1ml80℃备用。副溶血弧菌的培于中,in心1min,收集沉淀,3种细菌的DNA,DNA浓度,分装数管,-20℃保存备用。肠毒性大肠埃希菌基因浓度为145μg/ml,沙门菌基因浓度为100μg/ml,志贺菌基因浓度为70μg/ml。114　扩增的目的基因及引物设计

以肠毒性大肠埃希菌的编码LTB的基因,沙门菌的invA基因,志贺菌的ipaH基因为研究对象,根据Genbank中基因序列,应用Primer510引物设计软件设计如下三对特异性引物(表1)。

表1　多重PCR扩增的目的基因名称及序列号及引物设计

菌种

目的

NCBI

)引物序列(5′-3′

对影响多重PCR扩增条件如dNTP浓度、退火温度和引物浓度等进行优化,以确定最佳的PCR反应条件。通过单基因敏感度试验初步摸索出最佳模板浓度,根据多次试验和经验,对影响较大的因素:引物浓度、dNTP浓度和Tm值先初步

确定了一定的范围,然后设计了一个L16(43)的正交试验。

118　单管多重PCR的特异性和敏感性分析

11811　特异性试验　为进一步验证本实验设计的多重PCR

的特异性,分别以3种标准菌株提取的单一DNA为模板,同时加入3对引物进行扩增;再以3种标准菌株提取的混合DNA为模板,分别加入单对引物扩增。

11812　　3种细菌的模板100

-10

,按已优化

,测定多重PCR扩增1将3种菌培养液任意2种、3种等量混合,计算菌落总数,使每种菌的含量>104cfu/ml,接种于3种菌为阴性的2g生鸡蛋、奶粉、碎猪肉中培养一段时间后,取样品进行多重PCR检测。

2　结果

211　肠毒性大肠埃希菌的编码LTB的基因,沙门菌的invA基

因,志贺菌的ipaH基因的PCR扩增和核苷酸序列分析将金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌菌液等量分别与3种目的菌液混合后利 …… 此处隐藏：9943字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……