脑膜炎奈瑟菌基因分群方法建立与评价

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收稿日期:2007 08 23

(任旭红编辑 蔡天德校对)

文章编号:1001 0580(2008)05 0545 03 中图分类号:R742 文献标志码:A

实验研究

脑膜炎奈瑟菌基因分群方法建立与评价*

杨婷婷,程苏云,朱水荣,徐宝祥,王复

摘 要:目的 建立流脑实验室快速诊断及基因分群方法,进行群别分布研究及分群效率评估。方法 应用多

重PCR进行同步核酸鉴定及基因分群。平板菌落计数法评估敏感性,基因序列分析确定特异性。结果 PCR敏感性为83个菌落形成单位(CFU)/反应;多重PCR分群效率(100%)优于血清凝集法(82 02%),差异有统计学意义。其中带菌者分离株基因分群效率为100%,血清凝集法为65 71%;对与血清凝集分群法结果不同的菌株进行基因测序,分析结果与PCR分群结果相符;分离株菌群分布为A群60 69%,B群24 69%,C群14 62%,未检出其他群别。结论 所建立的基因鉴定及分群方法敏感性和特异性均优于血清凝集法,分群效率优于血清凝集法。

关键词:脑膜炎奈瑟菌;基因分群;流行病学StudyonthegenotypeandassessmentforNeisseriameningitidis YANGTing ting,CHENGSu yun,ZHUShui rong,etal.ZhejiangCenterforDiseaseControlandPrevention(Hangzhou310009,China)

Abstract:Objective TodevelopamethodforrapiddiagnosisandgenotypingforNeisseriameningitidis(N.m),andas sessthegenotypingefficiencyandgroupdistributioninepidemicseason2006,Zhejiang.Methods TheassayofmultiplexPCRwasestablishedforN.mdetectingandgenotypingsimultaneously.BothsensitivityandspecificityofmultiplexPCRwereevaluatedbycolonyformingunit(CFU)countingandgenesequencing,respectively.Results A)ThesensitivityofmultiplexPCRwas83CFU/reaction;B)Thegenotypingefficiency(100%,89/89)byusingthemultiplexPCRwassignificantlyhigherthantheserotyping(82.02%,73/89)byserumagglutinationreaction.Thegenotypingefficiencywas100%(35/35)whereastheserotypingwas65.71%(23/35)intheisolationsfromhealthcarriers;C)Thesequencingresultssupportedthegenotypingonesamongthesamplesinwhichthegenotypingresultsconflictedtoserotyping;D)ThegroupdistributionwasofA(60.69%,54/89),B(24.69%,22/89)andC(14.62%,13/89).NootherN.mgroupwasfoundinthisstudy.Conclusion BothsensitivityandspecificitybyemployingthemultiplexPCRwerehigherthanthosebyserumagglutinationreactionintheN.midentificationandgroup-typing.Thegenotypingwassuperiortoserotypingforgroupingefficacy.

Keywords:Neisseriameningitidis;genotype;epidemic 我国近几年流脑呈上升趋势,近期尚出现聚集性疫情 1 。分析脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis,N.m)菌群分布、变迁趋势、制定疫苗接种措施对该病的防控至关重要,及时准确诊断及分群鉴定对流脑早期监控和合理快速使用有效疫苗具有重要流行病学意义。脑膜炎奈瑟菌的传统诊断方法主要是细菌分离培养、染色镜检、生化鉴定和血清学分群、血清凝集等。本文建立脑膜炎奈瑟菌核酸诊断和快速基因分群方法,并对部分分离到的流脑菌株进行基因分群鉴定评价。结果报告如下。1 材料与方法

1 1 菌株及试剂 (1)脑膜炎奈瑟菌(N.m)分离株:分离自2005年11月~2006年6月浙江省流脑临床患者分离株54株、暴发疫情及带菌者调查中健康带菌者分离株35株。病例及带菌者资料来源于浙江省疾病监测系统。(2)阳性对照菌

*基金项目:浙江省科技厅立项资助(2006)

作者单位:浙江省疾病预防控制中心病原微生物检验所,杭州

310009

作者简介:杨婷婷(1957-),女,福建漳州人,主任医师,本科,主要

株:A、B、C群N.m株(中国生物制品检定所提供,本单位菌种室保存)。(3)阴性对照菌株:乙型溶血性链球菌( -hemolyticstreptococcus,S. -hemo),表皮葡萄球菌(Staphy lococcusepidermidis,S.epi)和霍乱弧菌(Vibriocholerae,V.cho)等(本单位分离并保存)。(4)试剂:APINH鉴定试剂(法国梅里埃公司);脑膜炎奈瑟菌单克隆抗体诊断血清(美国Remel公司);QiampDNA抽提试剂盒(美国Qiagen公司)。1 2 方法

1 2 1 菌株分离与鉴定 按常规方法进行。分别经样本处理、分离培养及生化鉴定等,符合脑膜炎奈瑟菌菌落形态、培养特性及生化特征。

1 2 2 血清凝集分群 按常规玻片凝集方法进行。1 2 3 基因分群 采用多重PCR方法进行。(1)核酸提取:使用QiampDNA抽提试剂盒,按说明书进行核酸提取,并置4 备PCR检测。(2)引物序列:根据已报告的引物序列

2-4

设计并合成特异性引物(上海生工公司合成),引物序列分别为,porA上游引物5 -CCGCACTGCCGCTTGCGG-3 ,下游5 -TAA-3 siaD(Y1)游引

546中国公共卫生2008年5月第24卷第5期 ChinJPublicHealthMay2008Vol.24No.5

物5 -CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA-3 ,下游引物5 -CTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA-3 ;mynB/sacB(A1)上游引物5 -CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-3 ,下游引物5 -CTGAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3 ;siaD(C1),上游引物5 -TCAAATGAGTTTGC GAATAGAAGGT-3 ,下游引物5 -CAATCACGATTTGC CCAATTGAC-3 ;siaD(B1)上游引物5 -GGAT CATTTCAGTGTTTTCCACCA-3 ,下游引物5 -GCAT GCTGGAGGAATAAGCATTAA-3 ;siaD(Y&W135)上游引物5 -GGTGAATCTTCCGAGCAGGAAA-3 ,下游引物5 -AAAGCTGCGCGGAAGAATAGTG-3 。(3)反应体系:10 PCRbuffer(Mg2+free)5 l,25mmol/L的MgCl24 l,dNTP4 l(每种2 5mmol/L,终浓度200mmol/L),每条引物除porA为0 8 l外,其他均为0 4 l(终浓度0 4 mol/L),Taq酶0 3 l(5U/ l,日本TaKaRa公司),待测模板2 l,加ddH20~50 l。(4)反应条件:针对不同反应管,所有循环条件经梯度PCR优化组合确定最佳条件为:94 预变性5min,94 60s,58 60s,72 90s,30个循环,最后72 延伸5min(Eppendorf)。(5)产物鉴定:扩增产物用1 5%琼脂糖凝胶(含EB0 5 g/ l)电泳(MiniRunGE-100型电泳仪)100V,45min,GENIUS凝胶成像仪(FR-200A型)获取图像。1 2 4 特异性试验 采用如上阴性对照菌株,并设模板阴性对照,按上述方法同时进行PCR扩增;对与血清凝集分群法结果不同的菌株,另取PCR扩增产物进行基因序列测定(上海生工公司),并与阳性参考株比对。

1 2 5 敏感性试验 采用平板菌落计数法对阳性参考株进行菌落计数:取0 5个麦氏单位浓度(约1 5 108/ml)的菌悬

液,作一系列的倍比稀释,取1000万个起连续10倍稀释至1个菌的稀释管,各取100 l菌液进行平板培养,根据培养出的菌落数,计算培养物中的活菌浓度。按上述方法同步进行PCR,测定方法敏感性。

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