蛋白酶的盐析沉淀实验报告

蛋白酶的盐析沉淀实验报告

班级：生工1005 学号：0203100520 姓名：朱同辉

实验目的：

1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素； 2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义； 3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法； 4.学习酶活力的计算方法。

实验原理：

盐析法

在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。

原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；

②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。

盐析效果： 二价离子 > 一价离子

离子半径小 > 离子半径大

阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-

蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn经验式来表示：

logS KsI

式中：S—蛋白质的溶解度 I—离子强度

β—常数，与温度和pH有关

I

12

cizi

2

Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算：

式中：ci—i 离子的浓度（mol/L） zi—i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定

福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。

酶活力

410

K N O.D680

蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算

K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数（μg），K值为

108.53

N—酶液稀释倍数

4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4 10—反应时间为10 min

参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍

实验步骤：

1）蛋白质盐析

分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。

将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于10℃，10,000 r/min离心20 min。

将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。

2）蛋白酶活力的测定：

1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min

2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中，40℃水浴中预热1-2min

3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min

4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支试管静置10min

5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色。

6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度，求出平均值。

3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算

计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。 以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出Ks和β的数值，建立起蛋白酶的盐析曲线。

数据记录及实验结果：

讨论：

通过本次试验，初步掌握了蛋白酶盐析沉淀及其酶活测定的方法。在开始实验时，对实

验的整体思路没有理解，仅仅盲目的按照步骤进行，导致浪费了很多时间，并且实验结果不理想。希望老师能在实验的前一周把讲义发给大家，进行充分的预习，对提高实验效率和准确度会有帮助。