类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

HEREDITAS (Beijing)

2013年4月, 35(4): 395―409 ISSN 0253-9772 http://doc.guandang.net

综 述

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00395

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

沈延, 肖安, 黄鹏, 王唯晔, 朱作言, 张博

北京大学生命科学学院, 细胞增殖与分化教育部重点实验室, 北京 100871

摘要: 人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列, 造成双链断裂, 从而引起基因

组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰, 开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶, 很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景, 重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略, 以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因, 特别是在斑马鱼中的应用, 为开展这一领域的研究工作提供参考。

关键词: 类转录激活因子效应物(TALE); 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN); 人工核酸内切酶(EEN);

基因组编辑; 基因组定点修饰

TALE nuclease engineering and targeted genome modification

SHEN Yan, XIAO An, HUANG Peng, WANG Wei-Ye, ZHU Zuo-Yan, ZHANG Bo

Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China

Abstract: Artificial designer nucleases targeting specific DNA sequences open up a new field for reverse genetics study. The rapid development of engineered endonucleases (EENs) enables targeted genome modification theoretically in any species. The construction of transcription activator-like effector nucleases (TALENs) is simpler with higher specificity and less toxicity than zinc-finger nucleases (ZFNs). Here, we summarized the recent progresses and prospects of TALEN tech-nology, with an emphasis on its structure, function, and construction strategies, as well as a collection of species and genes that have been successfully modified by TALENs, especially the application in zebrafish.

Keywords: transcription activator-like effector (TALE); transcription activator-like effector nuclease (TALEN);

engineered endonuclease (EEN); genome editing; targeted genome modification

收稿日期: 2012 11 12; 修回日期: 2013 01 24

基金项目:国家重大科学研究计划项目(编号：2011CBA01000和2012CB945101)和国家自然科学基金项目(编号：31110103904)资助

作者简介:沈延, 博士, 研究方向：斑马鱼遗传与发育机制。Tel : 010-62753077; E-mail: yshen@http://doc.guandang.net

通讯作者:张博, 博士, 教授, 研究方向：斑马鱼遗传与发育机制。E-mail: bzhang@http://doc.guandang.net

网络出版时间: 2013-2-22 14:02:53

URL: http://doc.guandang.net/kcms/detail/11.1913.R.20130222.1402.003.html

396 HEREDITAS (Beijing) 2013 第35卷

对复杂的基因组进行定点修饰, 无论对于生物学基础研究还是临床治疗都具有极大的吸引力。20世纪80年代末诞生了第一个基因敲除的小鼠(Mus musculus)模型, 科研工作者从此能够选择性地修改载有生命密码的基因组, 探讨基因的功能。遗憾的是, 在随后的20余年时间里, 基因组靶向修饰技术仅限于能够在小鼠、果蝇(Drosophila melanogaster)等极少数几个物种中实现。在这期间, 人们始终在设法寻求具有普适性的新的基因定点突变方法。近几年, 人工核酸内切酶(Engineered endonuclease, EEN)技术的出现与完善使这个梦想逐步变成了现实。

EEN是通过基因工程的方法, 将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一种人造蛋白, 它目前主要包括3种类型：锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)[1]、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN), 以及人工的大范围核酸酶(Meganuclease)。EEN主要包含两个结构域, 一个是DNA结合结构域, 用来特异识别并结合特定的DNA靶序列; 另一个是DNA切割结构域, 用来切割DNA靶序列, 造成DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)。DSB能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(Homologous recombination, HR)机制, 对这种DNA损伤进行修复。其中NHEJ是一种较为简单的修复方式, 但是保真度不高, 很容易造成DNA断裂处的序列发生改变, 产生DNA的小片段插入和/或缺失(indel), 进而造成基因突变。在存在同源序列的情况下, 还可以通过HR的方式进行修复, 不过效率相对较低。有报道DSB能提高同源重组介导的DNA损伤修复的频率。根据上述特性, NHEJ途径和HR途径在理论上都可以用于对感兴趣的目的基因进行遗传改造。

ZFN是第一种人工构建并成功应用的EEN, 迄今已经发展了16年[4], 这要归功于人们对于锌指转录因子和FokⅠ核酸内切酶的深入了解。虽然ZFN的出现大大促进了基因组靶向修饰技术, 但是, 由于锌指基序(motif)同其靶序列的对应性并不特异, 对于每一个特定的靶点, 往往需要构建庞大的锌指表达文库, 通过实验筛选出高效且特异结合靶序列的锌指蛋白; 而且在基因组上找到合适的ZFN靶点

也比较困难。事实上, 虽然人们已经开发出多种筛选方法, 但是获得有效的ZFN仍然是一个相当大的技术难题。因此, 人们一直希望能找到新的、核酸靶序列与蛋白质的motif之间对应性更强、便于预测的DNA结合结构域。幸运的是, 2009年, 有两个研究组同时报道, 类转录激活因子效应物(Transcrip-tion activator-like effector, TALE)就是这样一类理想的蛋白质[5,6]。迄今仅短短3年的时间, 基于TALE结构的人工核酸内切酶已经被成功地应用于包括芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、果蝇、斑马鱼(Danio rerio)、线虫(Caenorhabditis elegans)、大鼠(Rattus norvegicus)[12]、水稻(Oryza sativa)[13]、蟋蟀(Gryllus bimaculatus)[14]、家蚕(Bombyx mori)[15]、非洲爪蟾(Xenopus laevis)与热带爪蟾(Xenopus tropi-calis)、猪(Sus scrofa)和牛(Bos taurus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)在内的多个物种, 以及体外培养的哺乳动物细胞(包括人类细胞)[19,20](图1)。TALEN既能够像ZFN一样精确地修饰复杂的基因组, 又具有比ZFN更容易设计的优点, 对于遗传学的基础理论研究和应用研究来说, 无疑都是一个重大的飞跃。由于在TALEN组装技术和模式动物应用上的突破, EEN介导的基因组编辑技术在2012年1月被Nature Methods杂志评选为2011年度最受瞩目、最有影响力的年度生命科学技术[21]; 2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一。Science在评述中把TALEN称为基因组的“巡航导弹”, 还大胆预测TALEN技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能[22]。本文将从TALEN的结构、构建及其在基因组定点修饰中的应用等方 …… 此处隐藏：34859字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……