鲍曼不动杆菌耐药基因的克隆与特征

中国热带医学2007年第7卷第5期 CHINATROPICALMEDICINEVol 7No 5May2007

683[论 著]

鲍曼不动杆菌耐药基因的克隆与特征

沈峰,苏显中,房婷,户登

摘要:目的 对临床分离鲍曼不动杆菌进行耐药基因克隆。 方法 利用已知Acinetobactersp ADP1全序列设计引物,通过PCR扩增,进行耐药基因的克隆;对重组菌株进行药敏分析。 结果 克隆出一个耐药基因,该基因编码的蛋白对氯霉素、四环素和链霉素等抗生素及溴化乙锭、罗丹明6G、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠等抗菌剂具有很强耐药性。 结论 克隆到的耐药基因为一多重耐药基因。

关键词:多重耐药;基因克隆;鲍曼不动杆菌

中图分类号:R378 文献标识码:A 文章编号:1009-9727(2007)5-683-02

Thecloningandcharacterizationofadrug-resistantgeneinclinicalisolatesofAcinetobaterbaumannii.ShenFeng,SuXian-zhong,FANGTing,etal.(ChemicalEngineeringCollegeofChinaUniversityofMiningandTechnology,Xuzhou221116,Jiangsu,P.R.China)

Abstract:Objective Tocloneadrug-resistantgeneofAcinetobacterbaumanniisolatedfrom35clinicalpatients. Methods TheprimersweredesignedbasedongenomicDNAofAcinetobacterADP1,andPCRamplificationofdrug-resistantgenewascar riedoutusinggenomicDNAofAcinetobacterbaumannii35;Theminimalinhibitoryconcentrations(MICs)ofvariousdrugswerede terminedbyserialtwo-folddilutionmethod. Results Adrug-resistantgenewasclonedandthetransformantharboringrecombi nantplasmidshowedhighresistancetochloramphenicol,tetracycline,streptomycin,ethidiumbromide,rhodamine6G,DCandSDS. Conclusion Theclonedgeneisamultipleresistancegene.

Keywords:Multidrugresistance;Genecloning;Acinetobacterbaumannii

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是一种好氧的非发酵类革兰氏阴性杆菌。70年代,该菌被认为是非致病菌或条件致病菌,近年来,鲍曼不动杆菌逐渐成为ICU的重要感染菌,它可引起诸如肺炎、泌尿器官感染、心内膜炎、伤口感染、脑膜炎及败血病等,并且逐渐呈现多重耐药趋势[1,2]。2004年Kuo等人报道一种超强细菌 全抗药性鲍曼不动杆菌 在台湾多家医院蔓延,其对处方药物普遍存在抗性,感染这种细菌会造成严重的败血症与肺炎,患者的死亡率高达60%[3]。目前国内有关鲍曼不动杆菌多重耐药机制的研究文献较少,本文对临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药基因进行了克隆,并研究了其耐药特性,以期探讨鲍曼不动杆菌多重耐药的分子机制,为临床合理治疗鲍曼不动杆菌引起的感染提供参考。1 材料与方法1 1 材料

1 1 1 菌株和质粒 临床分离鲍曼不动杆菌35(Acinetobacterbaumannii35)由上海第二医科大学附属仁济医院应春妹副教授惠赠;药物超感受性菌株大肠埃希菌KAM32(Escherichia coliKAM32,主要药物外排基因acrB、ydhE已被破坏)[4]与质粒pUC19均为本实验室保藏。

1 1 2 工具酶及主要试剂 所用药品包括氨苄青霉素(Ampi cillin)、卡那霉素(Kanamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、四环素(Tetracycline)、红霉素(Erythromycin)、利福平(Rifampicin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、溴化乙锭(EthidiumBromide)、罗丹明6G(Rho

damine6G)、脱氧胆酸钠(DeoxycholicAcidSalt)、十二烷基硫酸钠(Dodecylsodiumsulfate)和链霉素硫酸盐(Streptomycinsulfate)等均购自上海生工,药物外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(Verapamil)购自百灵威化学技术有限公司,限制性内切酶及PCR反应试剂盒购自TaKaRa(大连)公司,引物由TaKaRa(大连)公司合成。

1 1 3 主要仪器 MJResearchPTC-100型PCR仪,BiofugePri moR冷冻离心机,DNA120离心浓缩仪,Gel-MediaSystem凝胶成像分析系统,DC-1006型低温恒温槽。1 2 方法

1 2 1 药敏分析 各种药物的最小抑制浓度(MinimumInhibi tionConcentration,MIC)在采用液体二倍稀释法配制成的含有不同药物浓度的MHB培养基中进行测试[4]。细菌细胞在37!培养24h后测试MIC值,每种药物MIC值取细菌细胞仍能生长的最低药物浓度。在进行药物外排泵抑制剂测试时,抑制剂CC CP与Verapamil的终浓度分别为1mg/L和100mg/L。

1 2 2 染色体DNA的制备 A baumannii35的染色体DNA采用ChenandKuo的方法[5]制备。

1 2 3 引物设计 使用Acinetobactersp ADP1的序列信息(http://cmr tigr org),利用软件Oligo6 0及Primer3设计引物。引物序列如下:

ACIAD2722F5 -CAGAATTCGGTAGGCTGGCACAACAGATA-3 ACIAD2722R5 -TAGAATTCGTGATAGATGCTTCTGGCTCACC-3

基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金资助项目;中国矿业大学科技基金(2005B014)

作者单位:中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221116

作者简介:沈峰(1982~),男,硕士生,主要从事细菌耐药机制的研究 :)男,,com

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其中划线部分为EcoRI的酶切位点,F为前引物,R为后引物。1 2 4 PCR扩增 PCR反应体系:DNA模板0 5 l,10#buffer(Mg2+free)5 l,MgCl2(2 5mM)3 l,dNTP(2 5mM)4 l,引物(10 M)各2 l,Taq酶(5U/ml)0 25 l,加ddH2O至50 l。PCR扩增条件:1)94!预变性,3min;2)循环参数为94!变性30s,50!退火1min,72!延伸1min,进行30个循环;3)72!,延伸5min。1 2 5 重组质粒的构建 PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKitVer 2 0,TaKaRa)回收所需片段,与质粒pUC19分别经EcoRI酶切,连接后转化到E coliKAM32感受态细胞中,重组质粒命名为pABS4。

1 2 6 扩增产物的序列测定及同源性分析 将PCR产物纯化后送TaKaRa(大连)公司进行DNA测序,测序结果在GenBank上用BLAST进行同源性检索分析。2 结果

2 1 35耐药基因的克隆与序列分析 以鲍曼不动杆菌35基因组DNA为模板,采用设计的基因引物进行PCR扩增,获得一条约0 92kb的阳性扩增条带(图1)。将该产物与经过处理的载体pUC19连接后获得重组质粒pABS4。

将测序得到的基因产物序列在GenBank中进行BLAST检索,并未发现与任何已知耐药基因序列具有高

度同源性。

个基因,由表1可以看出,重组菌株对氯霉素、四环素、链霉素、溴化乙锭、罗丹明6G、脱氧胆酸钠及十二烷基硫酸钠等结构与功能都不同的药物都表现出了4倍以上的耐药性,这说明所克隆的基因编译的蛋白是与药物耐性相关的,能够使含有此基因的重组菌株呈现多重耐药。

表1 转化子对各种药物的敏感性

Antimicrobial

agentsKanamycinNorfloxacinErythromycinChloramphenicolTetracyclineEthidiumBromideRhodamine6G

DCbSDScRifampicinStreptomycinsulfate

MIC( g/ml)

E coliE coliKAM32/pUC19KAM32/pABS4

12<0 0075

110 58262515640 5

<0 0075

282648250062542

Relative

Resistancea

21284844414

a RelativeResistance,MICinE coliharboringpABS4/MICinE coliharboringpUC19;b DC,DeoxycholicAcidSalt;c SDS,Dodecylsodiumsulfate。

基因序列同源性分析发现,该基因序列与已知的药物外排基因序列没有较高的同源性,利用外排泵抑制剂测 …… 此处隐藏：4431字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……