P1噬菌体转导敲除基因的实验步骤

P1噬菌体转导基因敲除操作步骤

实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。

大肠杆菌利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da，在复制过程中，头部包装时容易发生错误包装，可将其宿主菌（供体菌）的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌（受体菌）时，供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受体菌内，并可以与受体菌基因进行同源重组，从而永久性的存在于受体菌基因组上。P1转导的频率一般很低，需要选择性标记进行转导子筛选，本实验中为卡那霉素抗性基因（KmR）。

准备材料

LB液体试管，LB半固体培养基，LB固体培养基， 20%（w/v）葡萄糖溶液，1M CaCl2溶液，1M MgSO4溶液，氯仿，1M柠檬酸三钠溶液；

效价109-1010（pfu/mL） P1噬菌体储液，大肠杆菌溶源性供体菌，大肠杆菌受体菌； TM buffer：10mM Tris-HCl（pH7.4）buffer加入10mM MgSO4；

P1盐溶液：10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液；

实验步骤

平板培养法

准备野生菌种子液

自保存甘油管或划线培养平板上，转接到3mL LB液体试管中，37℃，250rpm，培养过夜（12hr）。

制备野生型P1噬菌体

1. 将野生型菌株的过夜种子液，按1%（v/v）转接5mL LB液体试管，摇床培养至对数中期（~2*108细胞/mL，OD600=0.2~0.3）。

2. 加入5mM CaCl2，继续培养至菌体细胞OD600=1。

3. 取出野生菌培养液，低温聚菌，加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。

4. 倒下层平板，LB固体培养基中加入5mM CaCl2。

5. 取2.5mL半固体LB培养基，加入0.25mL重悬菌液，混合均匀后倒在下层平板上，轻柔地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。（注意培养基的温度不可过高，以手触摸时感觉温度舒适，建议先分别分装到15mM无菌离心管内，待凉到温度适宜后加入菌液，迅速混匀倒平板。）

6. 待琼脂凝固后，点10ul P1噬菌体储液在上层细胞琼脂表面。待噬菌体储液被上层琼脂吸收后，将平板正置放置37℃培养过夜。对照板只有细胞，同样正置培养。（spot方法获得的噬菌体效价虽然高，但量太少，可能无法满足后续实验需求，可在步骤5中与上层细胞琼脂同时混合后倒平板，亦可获得高效价噬菌体）

7. 计算效价，刮取噬菌体。

转导大肠杆菌供体菌（keio collection）

1. 准备供体菌种子液，同野生型菌体。

2. 接种100uL至5mL LB液体试管中，接种前在LB液体中加入0.1%（w/v）葡萄糖。需接种两支试管，一支做对照用。振荡培养约1.5hr，至菌体达到对数生长期

（OD600=0.2~0.3）。

3. 加入5mM CaCl2，并转移到大试管或小锥形瓶中。

4. 加入50ul P1野生型噬菌体，混合均匀，37℃或室温静置20min。

5. 加入7.5mL上层半固体培养基，混合均匀后倒在下层平板上。上层琼脂混合前需加入0.1%

葡萄糖及2.5mM CaCl2。

6. 37℃恒温培养箱内正置培养过夜。

固体法操作步骤较为繁琐，但制备所得的噬菌体效价非常高。

液体培养法

（野生型噬菌体及特定基因型噬菌体均可以用液体培养法制备）

1. 准备3mL或5mL大肠杆菌供体菌（kieo collection）种子液，可同时准备受体菌种子液。

2. 在5mL LB液体试管中加入0.2%（w/v）的葡萄糖及5mM CaCl2，并接种1% 过夜培养供

体菌的种子液。

3. 30℃或37℃振荡培养30~45min。（同样需OD600达到0.2~0.3）

4. 加入100ul新制备的P1噬菌体（效价为109-1010（pfu/mL））。

5. 继续培养，直至裂解。（需做对照，如果对照管即不加入噬菌体的试管正常生长，而加入噬菌体

的试管裂解澄清，方为有效裂解）

6. 加入一小滴氯仿（100ul），继续振荡几分钟。

7. 转移上清至新的15mL无菌离心管中，9200*g，4℃，10min。

8. 转移上清至新的15mL无菌离心管(预先加入100ul氯仿)或分装至1.5mL EP管中，标注基

因型、制备人、日期等信息，4℃保存。

9. 过夜培养受体菌，3mL或5mL均可。亦可第二天培养，但需培养较长时间。

10. 次日，低速室温离心收集受体菌细胞，约需1.5mL培养液。

11. 弃上清，加入1/2体积的无菌P1盐溶液重悬菌体。

12. 分装菌体细胞，并加入不同体积的P1裂解液（基因型），对照管不加入P1裂解液。

13. 放置培养箱内静置30min。

14. 加入1mL加有200ul 1M柠檬酸三钠溶液的LB液体培养基。

15. 振荡培养1hr。

16. 室温，最大转速离心2min。

17. 弃净上清，加入100ul步骤14中的培养基，重悬细胞，涂布KmR平板。

pCP20质粒敲除KmR基因：

转化1ul pCP20质粒至100ul目的菌株的感受态细胞中，30℃振荡复苏，涂布AmR平板，30℃培养。影印AmR 及KmR平板，筛选敲除菌株。（可通过菌落PCR验证敲除是否正确） PFTA质粒敲除KmR基因：

1. 转化质粒PFTA至Bw△△，涂布AmR平板，30℃过夜。

2. 挑取一个单克隆接种至3mL LB+AmR培养基中，30℃培养。

3. 接种1~2滴培养物至10mL摇瓶中，摇瓶包裹锡纸，或者避光培养；30℃，培养6hr或更

长久。10mL：9mL（LB+AmR）+ 1mL（20mg/100mL 金霉素）

4. 加入3滴培养液至20mL LB中，42℃培养16hr（12~16hr）。

5. 划线或涂布LB平板，37℃培养过夜。

6. 检验抗性没有回复突变。

7. 获得单克隆